Chương 2: CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA QUÁ TRÌNH THỰC NGHIỆM
2.3. Phương pháp sắc ký cột
2.3.1. Giới thiệu về phương pháp sắc ký cột hở
Sắc ký cột hở được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển. Pha tĩnh thường là những hạt silica gel có kích thước tương đối lớn (50-150 μm) được nạp trong một cột thủy tinh. Mẫu chất cần phân tách được đặt ở phần trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một lớp bông thủy tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly được đặt phía trên cao. Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần bên dưới cột, được hứng vào những lọ đặt ngay ống dẫn ra của cột. Hệ thống như thế thường làm cho sự tách chậm, hiệu quả tách thấp so với sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Tuy vậy, sắc ký cột hở cũng có ưu điểm như pha tĩnh và dụng cụ thí nghiệm rẻ tiền, dễ kiếm, có thể triển khai với một lượng lớn mẫu chất.
2.3.2. Lựa chon dung môi bắt đầu cho quá trình sắc ký cột
Trước khi triển khai sắc ký cột, nhất thiết phải sử dụng sắc ký lớp mỏng để dò tìm hệ dung môi giải ly cho phù hợp, với các bước lần lượt như sau:
Bước 1: Mẫu cần sắc ký được hòa tan hoàn toàn trong dung môi phù hợp, với nồng độ 10 mg/mL, gọi là dung dịch mẫu.
Bước 2: Chuẩn bị 4-6 tấm bản mỏng 2,5 ×10 cm. Chấm lên những tấm bản này, mỗi tấm một chấm khoảng 2-5 L dung dich mẫu.
Bước 3: mỗi bản mỏng được triển khai với một loại dung môi giải ly khác nhau, kế đó hiện hình các vết trên bản bằng đèn UV hoặc bằng thuốc thử. Với dơn dung môi sẽ dễ dàng thấy được dung môi nào là phù hợp. Từ kết quà đó, cố gắng tìm hỗn hợp dung môi, trong đó một dung môi kém phân cực và một dung môi phân cực, thí dụ petroleum ether: ethyl acetate.
Bước 4: Đối với mẫu cao thô chiết từ cây cỏ (cao có chứa nhiều hợp chất từ không phân cực đến rất phân cực), chọn dung môi giải ly đầu tiên là dung môi có thể đẩy vết ít phân cực nhất của cao chiết, lên vị trí ở bản với Rf 0,5 và chọn dung
môi chấm dứt sắc ký cột là dung môi có thể đẩy vết phân cực nhất của cao chiết, lên vị trí ở bản với Rf 0,2. Sau khi chọn dung môi phù hợp, có thể áp dụng hệ dung môi này cho sắc ký cột. Giải ly trước tiên bằng dung môi không phân cực và tăng dần tính phân cực cho dung môi giải ly.
Lưu ý:
Phải sử dụng pha tĩnh của sắc ký lớp mỏng và của sắc ký cột giống nhau.
Dung môi giải ly cột là hệ dung môi đã chọn trong phần thực nghiệm nêu trên, nhưng phải chỉnh tỉ lệ dung môi sao cho có tính kém phân cực một ít so với hệ dung môi đã chọn. Bởi vì chất hấp thu, thí dụ silica gel tráng trên bản mỏng là loại silica gel dùng cho sắc ký lớp mỏng, với cỡ hạt nhuyễn mịn, lại được phun xịt tráng lên bản bằng áp lực lớn nên có độ chặt chẽ lớn. Trong khi đó chất hấp thu do nghiên cứu viên tự nạp cột trong phòng thí nghiệm là silica gel dùng cho sắc ký cột, với cỡ hạt lớn, lại được nạp vào cột ở áp suất thường, nên có tính lỏng lẻo hơn.
2.3.3. Tỉ lệ giữa lượng mẫu chất cần tách đối với kích thước cột
Sắc ký cột hở là sắc ký mà chất hấp thu được nhồi trong một cột bằng thủy tinh.
Kích cỡ của cột tùy thuộc vào số lượng mẫu chất cần phân tách. Cột nhỏ nhất có thể tích chỉ vài mL với đường kính cột vài mm, chiều dài cột vài cm, trong khi cột lớn nhất có đường kính cột vài cm và chiều dài cột dài tương ứng.
Muốn tách chất tốt, các kết quả thực nghiệm cho thấy các mối liên quan giữa lượng mẫu chất cần tách với kích thước cột, với hai điều sau đây:
Tỉ lệ giữa lượng mẫu cần tách và lượng chất hấp thu sử dụng.
Các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách tốt thì trọng lượng chất hấp thu phải lớn hơn 25-50 lần trọng lượng của mẫu cần sắc ký (tính theo trọng lượng). Tuy nhiên, với hỗn hợp các hợp chất khó tách riêng thì cần sử dụng số lượng lớn chất hấp thu nhiều hơn (lớn hơn 100-200 lần), còn với hỗn hợp dễ tách thì có thể sử dụng chất hấp thu ít hơn.
Vì thế trước khi tiến hành sắc ký, phải dự đoán trước rằng với một lượng mẫu chất muốn tách (x gam) phải cần bao nhiêu lượng chất hấp thu, sao cho chất hấp thu
16 chiếm một chiều cao phù hợp trong cột mà cột vẫn còn chỗ chứa dung môi. Với lượng chất hấp thu cụ thể, phải đi tìm một cột sắc ký với kích thước phù hợp.
Tỉ lệ giữa chiều cao chất hấp thu trong cột và đường kính trong của cột sắc ký.
Các khảo sát thực nghiệm cũng cho thấy muốn tách chất tốt, chiều cao của chất hấp thu nạp trong cột cần đạt tỷ lệ chiều cao chất hấp thu: đường kính của cột vào khoảng (10:1).
Muốn biết lượng chất hấp thu có phù hợp với cột thì cho chất hấp thu khô vào cột để quan sát.
2.3.4. Nạp chất hấp thu dạng sệt vào cột
Dùng kẹp để giữ cho cột thẳng đứng trên giá. Nếu phần đầu ra của cột không có miếng thủy tinh xốp để chặn thì có thể dùng một bông thủy tinh để chặn, tiếp theo phủ cát lên để có được một mặt bằng phẳng.
Chất hấp thu được nạp vào cột dạng sệt được chuẩn bị như sau:
Trong một becher đã có sẳn dung môi (dung môi là loại dung môi ít phân cực nhất được dùng để bắt đầu cho quá trình giải ly cột) cho chất hấp thu vào becher, đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa rót vừa khuấy nhẹ đều, lưu ý không được thực hiện ngược lại nghĩa là rót dung môi vào chất hấp thu bởi vì chất hấp thu gặp dung môi sẽ phát nhiệt, có thể làm chất hấp thu vón cục, sẽ không đồng nhất. Lượng dung môi sử dụng phải vừa đủ để hỗn hợp không được quá sệt khiến cho bọt khí sẽ bị bắt giữ trong cột và cũng không được quá lỏng.
Nhờ một phễu lọc có đuôi dài, đặt trên đầu cột, rót hỗn hợp sệt vào cột, vừa mở khóa nhẹ ở bên dưới cột để cho dung môi chảy ra, hứng vào một becher trống để ở bên dưới cột, dung môi này được sử dụng lại để rót trả lại đầu cột.
Tiếp tục rót chất sệt vào cột cho đến khi hết số lượng, vừa rót vừa dùng một thanh cao su khỏ nhẹ vào bên ngoài thành cột để chất hấp thu nén đều trong cột.
Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy ra và rót lại đầu cột vài ba lần để việc nạp cột được chặt chẽ, cho đến khi thấy chất hấp thu trong cột có dạng đồng nhất.
Lưu ý trong quá trình nạp cột, dung môi vẫn liên tục chảy nhẹ đều ra khỏi cột, hứng
lượng dung môi này sử dụng để rót trả lại trên đầu cột. Không được để cho đầu cột bị khô, nghĩa là luôn luôn có dung môi phủ trên phần đầu cột.
Sau khi nạp xong, mặt thoáng chất hấp thu ở đầu cột phải nằm ngang. Nếu mặt thoáng không nằm ngang, phải cho dung môi thêm cao lên trên phần đầu cột, dùng đũa thủy tinh khuấy đảo nhẹ phần dung môi gần sát mặt thoáng, làm xáo một phần chất hấp thu ở trên phần đầu cột, để yên, chất hấp thu lắng xuống từ từ tạo nên một mặt thoáng bằng phẳng.
2.3.5. Đặt mẫu chất cần tách lên đầu cột sắc ký
Có hai cách để nạp mẫu chất cần tách lên đầu cột: nạp mẫu chất dạng dung dịch và nạp mẫu chất dạng bột khô
Nạp mẫu chất ở dạng dung dịch
Nếu mẫu ở dạng chất lỏng, có thể cho trực tiếp mẫu lên đầu cột sắc ký. Nếu mẫu dạng rắn, hòa tan mẫu chất vào một lượng nhỏ dung môi loại dung môi khởi đầu cho sắc ký cột. Dung dịch mẫu có nồng độ càng đậm đặc càng tốt, vì như thế lớp dung dịch này nằm thành một lớp mỏng trên đầu cột.
Thực hiện việc nạp mẫu lên đầu cột như sau:
Mở khóa cho dung môi chảy ra khỏi cột, để hạ mức dung môi trong cột xuống sao cho vừa sát với mặt thoáng của chất hấp thu trong cột. Mặt thoáng của chất hấp thu lúc này phải nằm ngang đều.
Đóng khóa lại, nạp dung dịch mẫu lên đầu cột. Muốn nạp mẫu, sử dụng một pipet để hút dung dịch mẫu chất, đặt đầu của pipet gần sát với mặt thoáng của chất hấp thu trong cột, vừa bóp vừa rây pipet dọc quanh thành trong của cột, cho dung dịch chất chảy dọc ra theo thành trong của cột, chạm xuống bề mặt của chất hấp thu.
Mở khóa bên dưới cho dung môi chảy ra khỏi cột, làm cho đung dịch mẫu được thấm hết vào chất hấp thu trên đầu cột, cần canh chừng không cho chất hấp thu ở đầu cột bị khô.
Dùng pipet cho một lượng nhỏ dung môi mới lên đầu cột, tranh thủ dùng dung môi này để rửa sạch thành ống mà nãy giờ dung dịch mẫu chất đã trây dính trên thành cột. Lại mở khóa, cho dung môi chảy ra. Lặp lại vài lần việc rửa thành cột như thế để
18 giúp cho dung dịch mẫu chất thấm sâu vào phần chất hấp thu ở phần đầu cột. Lặp lại như thế cho đến khi một lượng ít dung môi lên đầu cột, dung môi sẽ luôn trong suốt không màu (không bị lây màu của chất mẫu).
Cho một lớp cát dầy khoảng 3-6 mm đặt nhẹ trên mặt thoáng của chất hấp thu để bảo vệ mặt cột. Nếu không có cát, có thể sử dụng bông thủy tinh, bông gòn, giấy lọc có đường kính vừa bằng với đường kính trong của cột. Cẩn thận để không làm xáo trộn bề mặt đang nằm ngay ngắn.
Cuối cùng cho dung môi vào đầy cột để bắt đầu quá trình giải ly.
Nạp mẫu chất ở dạng bột khô
Nếu chất mẫu không tan trong dung môi loại dung môi lựa chọn để bắt đầu quá trình giải ly cột, vì đây là loại dung môi kém phân cực, thay vì phải hòa tan mẫu trong dung môi phân cực có thể ảnh hưởng vào quá trình giải ly, có thể nạp mẫu “khô”.
Trong một bình cầu dùng để cô quay, mẫu chất cần sắc ký (X gam) được hòa tan trong dung môi như ethyl acetate hoặc methanol (50X gam), cho thêm vào silica gel cỡ hạt lớn (10X gam). Hỗn hợp này được cô quay chân không đến khi có bột silica gel khô, bấy giờ, mẫu cần sắc ký đã được tẩm lên bề mặt của những hạt silica gel.
Đặt mẫu bột khô này lên đầu cột, dùng một ít dung môi (loại lựa chọn để bắt đầu quá trình sắc ký cột), thấm ướt một phần bột silica gel. Cho một lớp cát dầy khoảng 3-6 mm đặt nhẹ lên trên mặt thoáng của chất hấp thu để bảo vệ mặt cột. Cuối cùng cho dung môi vào đầy cột để bắt đầu quá trình giải ly.
2.3.6. Theo dõi quá trình giải ly cột
Với các mẫu nguyên liệu ban đầu có màu, quá trình giải ly bằng sắc ký cột có thể theo dõi bằng mắt thường, nhờ nhìn thấy các dãy lớp có màu sắc ký khác nhau, đang tách xa nhau ra. Theo dõi các dãy màu và hứng chúng, khi được giải ly ra khỏi cột.
Nhưng đa số các hợp chất hữu cơ thường không có màu, nên dung dịch giải ly cũng trong suốt không màu, phải theo dõi bằng những cách khác nhau.
Phương pháp thông dụng nhất là hứng dung dịch giải ly trong những lọ có đánh số thứ tự. Hứng mỗi lọ một thể tích như nhau. Nên pha một lượng lớn dung môi giải ly để hạn chế sai lệch nồng độ trong mỗi lọ.
Dung dịch trong những lọ hứng sẽ được sắc ký lớp mỏng trên cùng một bản mỏng. Những lọ nào có kết quả sắc ký lớp mỏng giống nhau (giống nhau nhưng có thể chứa nhiều hợp chất, vì hỗn hợp) sẽ được gom chung lại với nhau thành một phân đoạn. Đuổi dung môi ở áp suất kém các phân đoạn này sẽ cho cao của phân đoạn đó.
2.3.7. Khi nào thay đổi dung môi giải ly cột
Sắc ký cột được khởi đầu bằng loại dung môi nào là do kết quả sắc ký trên cao ban đầu. Thí dụ khởi đầu sắc ký cột bằng petroleum ether, cứ tiếp tục giải ly cho đến khi lọ cuối cùng, hứng dung dịch giải ly ra, đuổi hết dung môi ra khỏi lọ này, cân lại không thấy có cặn hoặc còn cặn không đáng kể, hoặc đuổi bớt dung môi rồi chấm sắc ký lớp mỏng mà không còn hiện vết nữa. Điều này có nghĩa là dung môi petroleum ether đã lôi hết ra khỏi cột những hợp chất không phân cực trong cao đã nạp ở đầu cột.
Tiếp theo, cần tăng thêm độ phân cực cho dung môi giải ly để tiếp tục quá trình sắc ký cột. Lần lượt giải ly từ dung môi không phân cực đến dung môi phân cực.
20