Chương 3. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm
Các nhân tố nghiên cứu là chỉ tiêu nghiên cứu được chia thành các công thức thí nghiệm khác nhau, có công thức đối chứng.
Số mẫu đưa vào của mỗi công thức đủ lớn, số bình mẫu cho 1 lần lặp lại.
Thí nghiệm được lặp lại ba lần.
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, bình nuôi được đặt trong phòng nuôi cấy với điều kiện nhiệt độ duy trì ở 250C ± 20C và cường độ ánh sáng là 2.500lux, thời gian chiếu sáng 8 h/ngày.
Tạo vật liệu khởi đầu cho nuôi cấy Bước 1: Chọn lọc và xử lý mẫu
Chọn lọc những khóm mía to, khỏe, không có biểu hiện của sâu bệnh. Mẫu được lấy trong thời điểm thời tiết khô ráo, sau mưa ít nhất 1 tuần. Lấy ngọn hoặc chặt những cây non có từ 3 - 5 lóng.
Cây mía còn non có sức nảy mầm và khả năng tái sinh cao, ít hoạt chất thứ cấp làm đen môi trường so với cây già. Ngọn mía được cắt bỏ phiến lá, bóc tất cả các phần bẹ, lá già và các lá đã tiếp xúc với không khí, lau sạch bằng cồn etanol 70o. Từ khi chặt đến khi vào mẫu ngọn mía phải được dựng đứng cho phần ngon xuống dưới, phần gốc lên trên (để không có nước đọng trong bẹ lá). Vào mẫu càng sớm càng tốt.
Bước 2: Vào mẫu
Đưa ngọn vào buồng cấy vô trùng, bóc bỏ lần lượt các lớp bẹ và lá non bên ngoài cho tới khi chỉ còn lại phần ngọn với lá trắng nõn nằm sát chồi đỉnh, sau đó tách lấy phần chồi nách, chồi đỉnh làm vật liệu nuôi cấy. Đối với cây mía, mắt mía non (chồi ngủ) và chồi đỉnh thường được bao bọc trong nhiều lớp bẹ lá do vậy rất sạch không cần phải khử trùng.
Kích thước mẫu nuôi cấy
Chồi nách: đường kính 1.0cm × 1.0cm. Mật độ 2 chồi/bình
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 20 Chồi đỉnh: bóc bỏ lá non, lấy chồi non kích thước 1.5cm × 1.5cm. Mật độ 1 chồi/bình.
Chồi đỉnh và chồi nách được cấy vào môi trường gồm MS + 30 g/l đường + 15% nước dừa + 0.5 mg/l BAP + 6 g/l thạch. Mẫu cấy thẳng đứng, mắt hướng lên trên.
Bước 3: Tạo chồi và nhân nhanh chồi
Sau 1 tháng hoặc 3 tuần cấy chồi đỉnh, chồi non bắt đầu nhú ra, ta đem cắt bỏ lá và vỏ bao ngoài thật sạch, bổ dọc chồi mía thành 2 phần, cấy xuống mặt thạch để tế bào tiếp xúc trực tiếp với mặt thạch để chồi dễ dàng hút các chất dinh dưỡng và sinh ra nhiều chồi mới.
Các chồi mới được hình thành (chiều cao chồi là 1 cm) lại được cấy chuyển từ 8 - 10 lần vào môi trường nhân chồi, mỗi lần cấy chuyển cách nhau 2 - 3 tuần để nhân nhanh chồi, cấy chuyển từ lần 1 - lần 4, mật độ 5 chồi × 7 cụm/bình. Cấy chuyển từ lần 4 trở lên mật độ 5 chồi × 5 cụm/bình.
Sau khi nhân nhanh đủ số lượng chồi, sử dụng các chồi đó để thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu.
3.3.2 Các phương pháp nghiên cứu
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau kết hợp với 0,2 mg/l Kinetin lên quá trình nhân nhanh chồi của 02 giống Br 3280, QĐ 93 Với 6 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại.
1.CT1 (ĐC) : MS + 30 g/l đường saccharose + 6 g/l agar + 15% nước dừa 2. CT2 : MS + 30 g/l đường saccharose + 6 g/l agar + 15% nước dừa + 0,5
mg/l BAP
3.CT3 : MS + 30 g/l đường saccharose + 6 g/l agar + 15% nước dừa +1 mg/l BAP
4. CT4 : MS + 30 g/l đường saccharose + 6 g/l agar + 15% nước dừa + 1,5 mg/l BAP
5.CT5 : MS + 30 g/l đường saccharose + 6 g/l agar + 15% nước dừa + 2 mg/l BAP
6. CT6 : MS + 30 g/l đường saccharose + 6 g/l agar + 15% nước dừa + 2,5 mg/l BAP
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 21
+ Mục đích của thí nghiệm: Tìm được nồng độ thích hợp nhất của BAP bổ sung vào môi trường sao cho quá trình nhân nhanh chồi là tối ưu.
+ Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện tối ưu: nhiệt độ duy trì ở 25 ± 20C và cường độ ánh sáng là 2.500lux, thời gian chiếu sáng 8 h/ngày, pH = 5,75.
+ Mẫu cấy trong bình tam giác 250 ml với số lượng cấy: 5 chồi × 5 cụm × 6 bình.
+ Chỉ tiêu quan sát: Số chồi thu được sau 3 tuần nuôi cấy và tính được hệ số nhân chồi.
+ Công thức môi trường thích hợp sẽ được sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo.
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa lên quá trình nhân chồi của 02 giống Br 3280, QĐ 93
Với 5 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại:
1. CT 1 (ĐC) : MS + 30 g/l đường saccharose + 6 g/l agar + 2 mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin + nồng độ nước dừa 0%
2. CT 2 : MS + 30 g/l đường saccharose + 6 g/l agar + 2 mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin + nồng độ nước dừa 5%
3. CT 3 : MS + 30 g/l đường saccharose + 6 g/l agar + 2 mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin + nồng độ nước dừa 10%
4. CT 4 : MS + 30 g/l đường saccharose + 6 g/l agar + 2 mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin + nồng độ nước dừa 15%
5. CT 5 : MS + 30 g/l đường saccharose + 6 g/l agar + 2 mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin + nồng độ nước dừa 20%
+ Mục đích của thí nghiệm: Xác định được phần trăm thể tích của nước dừa cần bổ sung vào môi trường nuôi cấy sao cho môi trường là tối ưu nhất.
+ Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện tối ưu: nhiệt độ duy trì ở 25 ± 20C và cường độ ánh sáng là 2.500lux, thời gian chiếu sáng 8 h/ngày, pH = 5,75.
+ Mẫu cấy trong bình tam giác 250 ml với số lượng cấy: 5 chồi × 5 cụm × 10 bình.
+ Chỉ tiêu quan sát: Số chồi thu được sau 3 tuần nuôi cấy và tính được hệ số nhân chồi.
+ Công thức môi trường thích hợp sẽ được sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của trạng thái môi trường lên quá trình nhân chồi của 02 giống Br 3280, QĐ 93
Với 4 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại.
1. CT 1 (ĐC) : MS + 30 g/l đường saccharose + 2 mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin + nồng độ nước dừa 15% + 0 g/l agar
2. CT 2 : MS + 30 g/l đường saccharose + 2 mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin + nồng độ nước dừa 15% + 3 g/l agar
3. CT 3 : MS + 30 g/l đường saccharose + 2 mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin + nồng độ nước dừa 15% + 6 g/l agar
4. CT 4 : MS + 30 g/l đường saccharose + 2 mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin + nồng độ nước dừa 15% + 8 g/l agar
+ Mục đích của thí nghiệm: Xác định được hàm lượng agar tối ưu cần bổ sung vào môi trường.
+ Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện tối ưu: nhiệt độ duy trì ở 25±20C và cường độ ánh sáng là 2.500lux, thời gian chiếu sáng 8 h/ngày, pH = 5,75.
+ Mẫu cấy trong bình tam giác 250 ml với số lượng cấy: 5 chồi × 5 cụm × 10 bình.
+ Chỉ tiêu quan sát: Số chồi thu được sau 3 tuần nuôi cấy và tính được hệ số nhân chồi, số lá/ chồi, chiều cao chồi TB.
+ Công thức môi trường thích hợp sẽ được sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo.
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của dung tích môi trường lên quá trình nhân chồi của 02 giống Br 3280, QĐ 93
Với 3 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại.
1. CT 1 : MS + 30 g/l đường saccharose + 2 mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin + nồng độ nước dừa 15% + 6 g/l agar, với dung tích bình là 50 ml môi trường 2. CT 2 : MS + 30 g/l đường saccharose + 2 mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin +
nồng độ nước dừa 15% + 6 g/l agar, với dung tích bình là 60 ml môi trường 3. CT 3 : MS + 30 g/l đường saccharose + 2 mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin +
nồng độ nước dừa 15% + 6 g/l agar, với dung tích bình là 70 ml môi trường
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23 + Mục đích của thí nghiệm: Tìm được dung tích môi trường của bình như thế nào là phù hợp cho số chồi tạo thành là cao nhất.
+ Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện tối ưu: nhiệt độ duy trì ở 25 ± 20C và cường độ ánh sáng là 2.500lux, thời gian chiếu sáng 8 h/ngày, pH = 5,75.
+ Mẫu cấy trong bình tam giác 250 ml với số lượng cấy:
Giống Br 3280 cấy:
5 chồi × 3 cụm × 10 bình, 5 chồi × 5 cụm × 10 bình, 5 chồi × 7 cụm × 10 bình Giống QĐ 93 cấy:
5 chồi × 3 cụm × 10 bình, 5 chồi × 5 cụm × 10 bình, 5 chồi × 7 cụm × 10 bình + Chỉ tiêu quan sát: Số chồi thu được sau 3 tuần nuôi cấy và tính được hệ số nhân chồi.
+ Công thức môi trường thích hợp sẽ được sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo.
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau lên quá trình kéo dài chồi của 02 giống Br 3280, QĐ 93
Với 7 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại.
1. CT 1: MS + 30 g/l đường saccharose + 0,2 mg/l Kinetin + nồng độ nước dừa 15% + 6 g/l agar + dung tích bình là 60 ml môi trường + 0 mg/l BAP 2. CT 2: MS + 30 g/l đường saccharose + 0,2 mg/l Kinetin + nồng độ nước
dừa 15% + 6 g/l agar + dung tích bình là 60 ml môi trường + 0,1 mg/l BAP
3. CT 3: MS + 30 g/l đường saccharose + 0,2 mg/l Kinetin + nồng độ nước dừa 15% + 6 g/l agar + dung tích bình là 60 ml môi trường + 0,2 mg/l BAP
4. CT 4: MS + 30 g/l đường saccharose + 0,2 mg/l Kinetin + nồng độ nước dừa 15% + 6 g/l agar + dung tích bình là 60 ml môi trường + 0,3 mg/l BAP
5. CT 5: MS + 30 g/l đường saccharose + 0,2 mg/l Kinetin + nồng độ nước dừa 15% + 6 g/l agar + dung tích bình là 60 ml môi trường + 0,4 mg/l BAP
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24 6. CT 6: MS + 30 g/l đường saccharose + 0,2 mg/l Kinetin + nồng độ nước dừa 15% + 6 g/l agar + dung tích bình là 60 ml môi trường + 0,5 mg/l BAP
7. CT 7: MS + 30 g/l đường saccharose + 0,2 mg/l Kinetin + nồng độ nước dừa 15% + 6 g/l agar + dung tích bình là 60 ml môi trường + 0,6 mg/l BAP
+ Mục đích của thí nghiệm: Tìm được nồng độ thích hợp nhất của BAP bổ sung vào môi trường sao cho sự kéo dài chồi là tối ưu.
+ Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện tối ưu: nhiệt độ duy trì ở 25 ± 20C và cường độ ánh sáng là 2.500lux, thời gian chiếu sáng 8 h/ngày, pH = 5,75.
+ Mẫu cấy trong bình tam giác 250 ml với số lượng cấy: 5 chồi × 5 cụm × 10 bình.
+ Chỉ tiêu quan sát: Số chồi thu được sau 3 tuần nuôi cấy và tính được hệ số nhân chồi, số lá/ chồi, chiều cao chồi TB.
+ Công thức môi trường thích hợp sẽ được sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo.
Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA ở các nồng độ khác nhau lên quá trình ra rễ của 02 giống Br 3280, QĐ 93
Với 4 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại.
1. CT 1 : MS + 60 g/l đường saccharose + 0,2 mg/l Kinetin + 0 mg/l NAA 2. CT 2 : MS + 60 g/l đường saccharose + 0,2 mg/l Kinetin + 0,5 mg/l NAA 3. CT 3 : MS + 60 g/l đường saccharose + 0,2 mg/l Kinetin + 1mg/l NAA 4. CT 4 : MS + 60 g/l đường saccharose + 0,2 mg/l Kinetin + 1,5 mg/l NAA + Mục đích của thí nghiệm: Tìm được nồng độ thích hợp nhất của NAA bổ sung vào môi trường hình thành rễ sao cho số rễ và chiều dài rễ là tốt nhất.
+ Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện tối ưu: nhiệt độ duy trì ở 25 ± 20C và cường độ ánh sáng là 2.500lux, thời gian chiếu sáng 8 h/ngày, pH = 5,75.
+ Mẫu cấy trong bình tam giác 250 ml với số lượng cấy 50 cây × 30 bình.
+ Chỉ tiêu quan sát: Số rễ/cây, độ dài rễ, số lá/cây thu được sau 2 tuần nuôi cấy và tính được tỷ lệ rễ tạo thành.
+ Công thức môi trường thích hợp sẽ được sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25 Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất nền đến tỷ lệ sống của cây trên vườn ươm
1. CT 1 : Đất mùn 2. CT 2 : Đất mùn + cát
3. CT 3 : Đất mùn + cát + trấu hun
4. CT 4 : Đất mựn + trấu hun + ẳ phõn vi sinh 5. CT 5: Đất mựn + trấu hun + cỏt + ẳ phõn vi sinh
+ Mục đích của thí nghiệm: Tìm ra môi trường chứa các chất nền thích hợp để đưa cây ra vườn ươm với tỷ lệ sống là cao nhất.
+ Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện tối ưu nhất về nhiệt độ, pH, ánh sáng, độ ẩm 80%, nồng độ oxy, tỷ lệ các thành phần của giá thể tính theo thể tích
+ Chỉ tiêu quan sát: Số cây/ khóm, chiều cao cây, số lá/cây sau 10, 20, 30 ngày.
+ Công thức môi trường thích hợp sẽ được sử dụng để đưa ra trồng hàng loạt trên đồng ruộng.
3.3.3 Các hóa chất và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 3.3.3.1 Hóa chất
- Hóa chất khử trùng : cồn - Môi trường MS cơ bản - Saccharose
- Agar - Nước dừa
- Các chất kích thích sinh trưởng: BAP, Kinetine, α-NAA 3.3.3.2 Thiết bị
- Máy đo pH - Máy khuấy từ
- Cân phân tích 10-4, cân kỹ thuật 10-2 - Bếp ga
- Lò vi sóng - Tủ sấy
- Nồi hấp vô trùng - Box cấy vô trùng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26 3.3.4 Các chỉ tiêu theo dõi
A. Đánh giá hệ số nhân
- Hệ số nhân chồi (lần) = ∑Số chồi thu được/∑Số chồi cấy vào B. Đánh giá khả năng tạo rễ
- Tỷ lệ ra rễ (%) = ( ∑Số cây ra rễ/∑Số cây cấy vào) × 100 - Số rễ trung bình/cây = ∑Số rễ tạo thành/∑Số chồi ra rễ - Chiều dài rễ trung bình (cm)= ∑Chiều dài rễ/∑Số rễ C. Đánh giá khả năng sống sót khi ra vườn ươm