Die Methode der Bisulfit-Sequenzierung ermửglicht es den Methylierungsstatus aller Cytosine in CpG-Dinukleotiden eines DNA-Amplifikates zu bestimmen. Die Bisulfit-Konvertierung gewọhrleistet die Unterscheidung zwischen methylierten und nicht-methylierten Cytosinen.
Letztere erscheinen als TpG-Dinukleotide in der Sequenz. Diese Unterschiede werden nach einer Sanger-Sequenzierung durch den Vergleich der Ergebnisse mit der Ausgangssequenz mit Hilfe einer speziellen Software bestimmt.
Mit Hilfe der Bisulfit-Sequenzierung konnte ein ĩberblick ỹber den Methylierungs-Status der einzelnen CpG-Stellen innerhalb der Marker-Loci gewonnen werden.
2.2.6.1 PCR-Amplifikation
Für bestimmte Amplifikations-Primer erwies sich eine Reaktionszusammensetzung mit einer hửheren MgCl2-Konzentration als optimal, um unspezifische PCR-Produkte zu vermeiden. Andere Primer haben besser in einem PCR-Gemisch ohne zusọtzliche MgCl2-Zugabe funktioniert.
Deswegen beinhaltet das PCR-Protokoll zwei verschiedene Zusammensetzungen. Alle Primer wurden fỹr die Amplifikation in einer Konzentration von 4,5 pmol benửtigt.
In dieser Arbeit werden für jeden Marker zwei Namen verwendet. Der zweite Name stellt eine systematische Benennung für die Patentanmeldung dar.
Tabelle 2 Alte und neue Marker-Bezeichnungen
Ursprüngliche Bezeichnung Neue Bezeichnung Nachweis von
1572 Blut-1 Peripheres Blut
Blut4 Blut-2 Peripheres Blut
Men8 Mens-1 Menstrualblut
21867 Mens-2 Menstrualblut
Spei7 Spei-1 Speichel
1622 Spei-2 Speichel
1628 Vag-1 Vaginalflüssigkeit
SpVa1 Vag-2 Vaginalflüssigkeit
Men1 Sperm-1 Sperma
Men3 Sperm-2 Sperma
Haut1 Haut-1 Haut (-schuppen)
Sprm1 Geschl-1 Geschlecht (mọnnl., weibl.)
Sprm3 Geschl-2 Mọnnliches Blut/Sperma
Die Amplifikations-Primer tragen die Bezeichnungen der Marker mit voran gestellten Abkürzung
"AMP" und die Benennung der beiden Forward- und Reverse-Primer, in Abhọngigkeit von dem Bisu-Strang, an dem die Amplifikation stattfindet ("o" und "p" für die beiden Primer an dem 1.
Bisu-Strang, "q" und "r" für die an dem 2. Bisu-Strang).
Für die Primer Blut-1, Blut-2, Spei-1, Spei-2, Vag-1, Vag-2, Sperm-1 und Haut-1 ist das Reaktions-Gemisch (Neu) wie folgt zusammengesetzt:
PCR-Komponente - Neue Zusammensetzung Volumen je Reaktion (àl)
Wasser 14,30
PCR-Buffer 10x 2,50
MgCl2 (25mM) 2,00
dNTP Mix (2,5 pmol each) 2,00
Hot Start Taq-Polymerase (Qiagen) 0,20
Primer (4,5 pmol) 3,00
Bisulfitierte DNA 1,00
Die Primer Mens-1, Mens-2, Seprm-2, Geschl-1 und Geschl-2 sind hingegen unter folgenden Bedingungen (Alt) effektiver.
PCR-Komponente - Alte Zusammensetzung Volumen je Reaktion in àl
Wasser 18,10
PCR-Buffer 10x 2,50
dNTP Mix (je 25 pmol) 0,20
Hot Start Taq-Polymerase (Qiagen) 0,20
Primer (4,5 pmol) 3,00
Bisulfitierte DNA 1,00
Das ursprüngliche PCR-Programm wurde nach dem Touchdown-Prinzip von Korbie & Mattick (2008) modifiziert. In dem nachfolgenden PCR-Protokoll wird die Annealing-Temperatur in 3
Schritten von 56°C auf 54°C abgesenkt. Das PCR-Programm ist für alle Marker gleich, da alle Primer eine ungefọhr gleiche Schmelztemperatur von 58°C aufweisen.
Cycling-Parameter
(1) Denaturierung 15 min 95°C
(2) Denaturierung 1 min 95°C
(3) Annealing 45 sec 56°C
(4) Elongation 1 min 72°C
→ go to (2) 9 x
(5) Denaturierung 1 min 95°C
(6) Annealing 45 sec 55°C
(7) Elongation 1 min 72°C
→ go to (5) 15 x
(8) Denaturierung 1 min 95°C
(9) Annealing 45 sec 54°C
(10) Elongation 1 min 72°C
→ go to (8) 14 x
(11) Elongation 10 min 72°C
(12) Cool down ∞ 8°C
2.2.6.2 Enzymatische Aufreinigung der PCR-Produkte
Fỹr jeweils 5àL aufzureinigendes Produkt wurden 1,0 àL Alkaline Phosphatase FastAP (1U/àL), 0,25 àL ExoI (10U/àL), 0,5 àL Puffer (10x Konz.) und 0,25àl Wasser gemischt und zupipettiert.
Das Temperaturprogramm für den Thermo-Cycler beginnt mit 37°C, die 90 Minuten gehalten werden. Anschlieòend wird das Gemisch fỹr 15 Minuten auf 85°C erhitzt und am Ende auf 8°C abgekühlt.
2.2.6.3 Sequenzier-Reaktion
Für die Sanger-Sequenzierung der Amplifikationsprodukte wurde der kommerzieller Kit BigDye®
Terminator Cycle Sequencing Kit v1.1 von Applied Biosystems by Life Technologies verwendet.
Zusọtzlich zu den im Kit bereits enthaltenen dNTPs, wurde eine weitere dNTP-Lửsung (0,1pmol) in die Reaktion zugegeben. Damit wurden die stark verschobenen Basen-Anteile in den bisulfitierten DNA-Strọngen ausgeglichen.
Cycling-Parameter
(1) Denaturierung 2 min 96°C
(2) Denaturierung 30 sec 96°C
(3) Annealing 15 sec 55°C
(4) Elongation 4 min 60°C
→ go to (2) 24 x
(5) Cool down ∞ 4°C
2.2.6.4 Sequenzierung der Marker-Amplifikate
Zur Entfernung der restlichen, freien Komponenten aus der Sequenzier-Reaktion wurde der DTR V3 96-Well Short Plate Kits der Firma EdgeBio verwendet. Die Reinigungs-Platten wurden entsprechend dem Hersteller-Protokoll vorbereitet, die Reaktionsansọtze auf das Gelbett der Platte aufgetragen und bei 850 G 5 min zentrifugiert. Die gereinigten Sequenzierprodukte wurden mit 10àl Hi-Di Formamid gemischt und bei 90°C 3 Minuten denaturiert. Die kapillarelektrophoretische Auftrennung der fluoreszenzmarkierten DNA-Fragmente erfolgte in einem ABI 3730 DNA Analyzer mit Einstellungen für das Standard Sequencing Run-Modul mit 36cm-Array, den POP-7 Performance Polymer als Trennmedium sowie den BigDye Set E. Die primọre Datenauswertung erfolgte mit der ABI Sequencing Analysis Software v5.2 in Verbindung mit der KB Basecaller und im weiteren Verlauf mit dem Programm ESME.
2.2.6.5 Datenauswertung: ESME-Analyse
Die Analyse der aus dem ABI-Basecaller resultierenden Sequenzen in Form von ab1-Dateien wurde mit Hilfe einer von Epigenomics entwickelten Software (ESME) durchgeführt (Lewin et al.
2004). Mit Hilfe dieses Programms wird der Methylierungs-Status durch das Verhọltnis der ỹberlagerten C- und T-Signale an jeder einzelnen CpG-Stelle abgeschọtzt.
Für die Analyse werden die ab1-Sequenzdateien sowie die für das Amplikon-Design verwendeten Marker-Sequenzen in Text-Format, benửtigt. Zunọchst normalisiert die Software die Cytosin- Signale in der Sequenz, da diese in der direkten Bisulfit-Sequenzierung meist überproportional zu den anderen drei Signalarten skaliert sind (Lewin et al. 2004). Danach wird die Bisulfitsequenz mit der jeweiligen Referenzsequenz zur Deckung gebracht. Anschlieòen werden die durchschnittlichen DNA-Methylierungswerte durch Auswertung von C und T Signalen an CpG Positionen berechnet.
Die berechneten Werte werden in Form einer Gelb-Blau Farbskala (von gelb= 0% methyliert bis blau= 100% methyliert) in einer ĩbersichts-Matrix dargestellt. In den Reihen werden pro Amplikon die einzelnen CpGs und in den Spalten die einzelnen Proben angeordnet. Zusọtzlich erstellt ESME Bilddateien von den einzelnen Sequenzen und eine Text-Tabelle mit den Methylierungs-Werten der analysierten CpGs in den Sequenzen. Mit Hilfe der Bilddateien kann die Richtigkeit der angegebenen prozentualen Methylierung überprüfen werden und, falls notwendig, in der Text-Tabelle korrigiert werden. Die korrigierte Tabelle kann in die korrigierte Matrix umgewandelt werden.