IV.1. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất Steroid
Cân 1 g bột khô, cho vào 20 ml CHCl3 và ngâm trong 2 giờ. Sau đó, lọc lấy dịch trong làm mẫu thử.
Thuốc thử:
- Salkowsky: H2SO4đđ (1ml).
- Libermann-Burchard: (CH3CO)2O (20ml), H2SO4đđ (1ml).
Tiến hành:
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch mẫu, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng giọt đến hết 1 ml các thuốc thử theo thành ống nghiệm. Để yên quan sát.
Hiện tượng:
- Thuốc thử Salkowsky: lớp H2SO4 (ở trên ) có màu xanh và lớp CHCl3 (ở dưới ) có màu nâu đỏ.
- Thuốc thử Libermann-Burchard: có vòng ngăn cách giữa hai lớp chất lỏng có màu từ hồng đến xanh lá cây.
Có sự hiện diện của hợp chất steroid.
IV.2 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất Flavonoid
Đun hoàn lưu 5 g bột mẫu trong 50 ml EtOH 960 trong 30 phút. Lọc lấy dịch trong làm mẫu thử.
Thuốc thử:
HClđđ + Mgbột + Terbutanol + H2SO4đđ+ dung dịch FeCl3 1%.
Tiến hành:
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch mẫu, thêm vài giọt HClđđ. Sau đó, cho một ít bột Mg vào và lắc. Thêm từ từ từng giọt terbutanol vào, để yên quan sát.
Hiện tượng: Thấy xuất hiện màu hồng hoặc tím. - Thử với FeCl3 1% tạo kết tủa màu xanh lục đen.
- Thử với H2SO4 đậm đặc dung dịch chuyển sang màu vàng đến đỏ hoặc xanh dương.
Có sự hiện diện của flavanoid.
IV.3 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất Alkaloid
Cân 5 g bột khô ngâm với 80 ml HCl 1% trong 4-6 giờ. Lọc lấy dịch trong làm mẫu thử.
Thuốc thử:
- Thuốc thử Dragendoff (hay KBiI4 – Kalitetraiodobismutat III): Hòa tan 8 g NitratBismuth Bi(NO3)3.H2O trong 25 ml HNO3 30% (d=1,18). Hòa tan 28 g KI và 1 ml HCl 6N trong 5 ml nước cất. Hỗn hợp 2 dung dịch, để yên trong tủ lạnh 5oC cho tủa màu sậm và tan trở lại, lọc và thêm nước cho đủ 100 ml. Dung dịch màu cam – đỏ được chứa trong chai màu nâu.
- Thuốc thử Wagner (KI3): Hòa tan 1,27 g iod I2 và 2 g KI trong 20 ml nước cất, thêm nước tới 100 ml.
- Thuốc thử Mayer (K2HgI4): Hòa tan 1,36 g HgCl2 trong 60 ml nước cất và hòa tan 5 g KI trong 10 ml nước cất. Hỗn hợp hai dung dịch và thêm nước cho đủ 100 ml.
Tiến hành:
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch mẫu, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng giọt đến hết 1 ml các thuốc thử theo thành ống nghiệm, lắc đều, để yên, quan sát.
Hiện tượng:
- Thuốc thử Dragendoff: dấu hiệu là kết tủa từ vàng cam đến đỏ. - Thuốc thử Wagner: dấu hiệu là màu nâu sáng đến màu nâu đen. - Thuốc thử Mayer: dấu hiệu là kết tủa màu trắng hay vàng. Có sự hiện diện của alkaloid
IV.4 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất Saponin
V.4.1 Dựa vào chỉ số tạo bọt để xác định sự hiện diện của saponin
Cơ sở của phương pháp
Dược điển của Pháp định nghĩa chỉ số tạo bọt của saponin là độ loãng của nguyên liệu bằng nước để có chiều cao bọt 1 cm sau khi lắc trong ống nghiệm có kích thước xác định, tiến hành trong điều kiện quy định.
Cách tiến hành và dấu hiệu nhận biết
Cân 1 g bột cỏ mực cho vào erlen 500 ml chứa sẵn 100 ml nước sôi. Tiếp tục cho nước trong erlen sôi trong 30 phút nữa. Lọc, để nguội, thêm nước cất cho đến 100 ml. Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16 cm, đường kính 16 mm. Cho vào các ống nghiệm lần lượt 1, 2, 3, 4, 5,…, 10 ml dịch lọc. Thêm nước cất vào mỗi ống cho đủ 10 ml. Bịt miệng ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc của ống trong 15 giây, mỗi giây lắc 2 lần. Để yên trong 15 phút, sau đó đo chiều cao các cột bọt.
Chỉ số bọt (CSB) được tính theo công thức: CSB = 100x10i
Trong đó:
CSB: Chỉ số bọt.
i: Số thứ tự của ống nghiệm đầu tiên có cột bọt cao 1 cm.
Nếu cột bọt trong các ống nghiệm thấp dưới 1 cm (tức chỉ số tạo bọt dưới 100) thì coi như không có saponin.
IV.4.2 Dựa vào các phản ứng đặc trưng
Cân 5 g bột khô cho vào erlen 500 ml chứa sẵn 100 ml nước sôi. Tiếp tục cho nước trong erlen sôi nhẹ trong 30 phút, lọc, để nguội. Cho khoảng 1 ml vào ống nghiệm nhỏ và lắc mạnh thì có bọt (cột bọt cao 1,5-2 cm).
Thuốc thử:
Liebermann-Burchard: (CH3CO)2O, H2SO4đđ.
Tiến hành:
Hòa tan mẫu bằng 1 ml (CH3CO)2O, thêm từ từ 0,3-0,5 ml H2SO4đ.
Hiện tượng:
- Thấy vòng cách màu xanh lá cây thì có saponin steroid.
- Thấy vòng cách màu hồng đến đỏ tím thì có saponin triterpene.
IV.5 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất Tanin
Cân 5 g bột khô, thêm vào 100 ml nước cất, đun sôi trong 10 phút. Lọc lấy dịch trong làm mẫu thử.
Thuốc thử:
- Thuốc thử Stiasny: Formol 36% (20 ml) + HCl đậm đặc (10 ml). - Dung dịch (CH3COO)2Pb bão hòa trong nước.
- Dung dịch FeCl3 1% trong nước.
Tiến hành:
Lấy 2ml dung dịch lọc, thêm 2-4 giọt dung dịch thuốc thử.
Hiện tượng:
- Thuốc thử Stiasny: Có trầm hiện đỏ.
- Dung dịch (CH3COO)2Pb: Thấy xuất hiện kết tủa màu vàng nhạt. - Dung dịch FeCl3: dung dịch chuyển thành màu xanh đen hoặc lục đen. Có sự hiện diện của tamin.
IV.6 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất Glycosyde
Lấy 10 g bột khô loại các chất không phân cực bằng PE. Tiếp theo chiết với EtOH 500. Dịch lọc được loại tạp chất bằng (CH3COO)2Pb cho đến khi không còn trầm hiện. Sau đó
loại (CH3COO)2Pb dư bằng Na2SO4 bão hòa. Cô cạn dịch lọc được cao glycosyde thô. Hòa tan cao này bằng EtOH 95% và lấy dung dịch này làm mẫu thử.
Thuốc thử:
- Tollens: dung dịch AgNO3 10% (1ml) + dung dịch NaOH 10% (1ml) + dung dịch NH4OH 25% từ từng giọt.
- Fehling:
+ Dung dịch A: CuSO4.5H2O (40g) + H2O, định mức vừa đủ 1lít.
+ Dung dịch B: KNaC4H4O6.4H2O (200g) + NaOH (150g) + H2O, định mức vừa đủ 1 lít.
Khi sử dụng thì trộn hai dung dịch lại với nhau.
Tiến hành:
Lấy 1ml mẫu thử, cho vào từng giọt cho đến hết 1 ml các thuốc thử.
Hiện tượng:
- Thuốc thử Tollens: Thấy xuất hiện kết tủa Ag.
- Thuốc thử Fehling: Đun sôi ống nghiệm trên đèn cồn trong 1 phút, thấy xuất hiện kết tủa đỏ gạch.
Có sự hiện diện glycosyde.
IV.7 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất Coumarine
Đun hoàn lưu 5 g bột mẫu trong 50ml EtOH 960 trong 30 phút. Lọc lấy dịch trong làm mẫu thử.
Thuốc thử:
Dung dịch NaOH 10% (0,5ml), HClđđ (vài giọt), H2O (12ml), dung dịch Na2CO3
10% (2ml).
Tiến hành:
- Phản ứng mở vòng lacton: Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2 ml dịch thử, thêm vào 1 trong 2 ống 0,5 ml dung dịch NaOH 10%. Đun cả hai ống trên bếp cách thủy đến sôi, lấy ra để nguội, thêm vào mỗi ống 4 ml H2O. Nếu chất lỏng trong ống có kiềm trong hơn ống không kiềm có thể xem là dương tính. Tiếp tục, đem acid hóa ống có kiềm với
vài giọt HClđđ, nếu dung dịch đang trong suốt lại xuất hiện vẩn đục hoặc kết tủa thì đó là dấu hiệu dương tính.
- Phản ứng diazo hóa: Lấy 2 ml mẫu vào ống nghiệm, thêm vào 2 ml dung dịch Na2CO3 10% và 4 ml H2O. Nếu dung dịch trong ống chuyển sang màu đỏ thẫm là dương tính.
IV.8 Kết quả định tính
Bảng 4. Kết quả định tính thành phần hóa học cây Cỏ mực
STT HỢP
CHẤT THUỐC THỬ HIỆN TƯỢNG
KẾT LUẬN
1 Steroid
Salkowski Lớp CHCl3 màu đỏ +++
Liebermann-Burchard Vòng ngăn cách màu lục +++
2 Flavonoid
HCl đđ/Mg/alcol tert butyl Dung dịnh có màu hồng +++
FeCl3 Có kết tủa xanh lục đen +
H2SO4 đđ Dung dịnh đổi màu -
3 Alcaloid
Dragondoff Kết tủa vàng cam +
Wagner Kết tủa màu nâu +
Mayer Kết tủa trắng đục -
4 Saponin Liebermann-Burchard Thấy vòng cách màu đỏ ++
5 Tanin
Stiasny Trầm hiện đỏ +
Pb(CH3COO)2 Kết tủa vàng nhạt +
FeCl3 Xanh lục đen +
6 Glycosid Tollen Kết tủa trắng bạc +++
Fehling Kết tủa màu đỏ gạch ++
7 Coumarine Phản ứng mở vòng lacton Ống 2 trong hơn ống 1 +
Chú thích: (+) Dương tính;(++) Dương tính rõ; (+++) Dương tính rất rõ.
Như vậy, trong cây Cỏ mực có sự hiện diện của Alkaloid, Flavonoid, Steroid, Coumarine, Saponin, Tanin, Glycosid.
Phần hình ảnh định tính được trình bày ở phụ lục 5 (trang PL10, PL11).
V. QUÁ TRÌNH CÔ LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC HỢP CHẤT TRÊN CAO ETYL ACETAT
V.1. Quá trình điều chế cao PE
Cây Cỏ mực được nghiền thành bột có khối lượng là 2 kg. Sau đó, cho vào thùng nhựa ngâm với etanol tuyệt đối trong 5 ngày. Tiến hành thu hồi dung môi dưới áp suất thấp ta được cao Etanol (cao EtOH) có khối lượng là 120g.
Từ cao EtOH đuổi hết dung môi, sau đó cho vào bình lóng chiết với 2 lít Ete dầu hỏa (PE), thu lấy dịch PE và thu hồi dung môi dưới áp suất thấp ta được cao Ete dầu hỏa (cao PE) có khối lượng là 55 g.
V.2. Quá trình điều chế cao Etyl acetat
Phần không tan trong PE tiến hành chiết với 2 lít Etyl acetat (EtOAc), thu dịch EtOAc và thu hồi dung môi dưới áp suất thấp ta được cao EtOAc 14 g.
V.3. Chọn hệ dung môi cho quá trình giải ly cột
Tiến hành sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi CLF:PE (6:4) và hiện vết với thuốc thử H2SO4 10%, thấy vệt tách tốt nên chọn hệ dung môi CLF:PE cho quá trình bắt đầu giải ly cột.
V.4. Cô lập và tinh chế hợp chất từ cao Etyl acetat
Cao Etyl acetat thu được ta tiến hành sắc ký cột silicagel (200-400 mesh) với các dung môi giải ly là: Ete dầu hỏa, Chloroform và Methanol. Các dung môi trích từ cột sắc ký, sau đó đem cô cạn. Theo dõi quá trình sắc ký cột silica gel bằng sắc ký lớp mỏng với thuốc hiện hình là dung dịch H2SO4 10%.
Đường kính cột: 5 cm
Khối lượng silica gel 200-400 mesh: 350 g Khối lượng cao Etyl acetat sử dụng: 14 g
Kết quả sắc ký quá trình sắc ký cột silica gel được trình bày tóm tắt trong bảng 5.
Bảng 5. Kết quả sắc ký quá trình sắc ký cột Phân
đoạn
Số lọ Hệ dung môi giải ly (PE:CLF) (CLF:MeOH)
Kết quả sắc ký lớp mỏng Khối lượng (g) LV1 1 - 50 PE 100% Có nhiều vết mờ 0,005 LV2 51 - 127 PE:CLF = 95:5 4 vết 0,01 LV3 128 - 200 PE:CLF = 90:10 1 vết kéo vệt 0,02 LV4 201 - 265 PE:CLF = 85:15 1 vết kéo vệt 0,5 LV5 266 - 303 PE:CLF = 80:20 3 vết 0,65
LV6 304 - 355 PE:CLF = 70:30 1 vết màu xanh nhạt 0,8
LV7 356 - 420 PE:CLF = 50:50 2 vết 0,07
LV8 421 - 495 PE:CLF = 30:70 Nhiều vết 0,75
LV9 496 - 586 CLF 100% 3 vết 1,45
LV10 587 - 634 CLF:MeOH = 90:10 Một vết tròn màu tím
đậm 0,95 LV12 635-670 CLF:MeOH = 80:20 3 vết 1,2 LV13 671-698 MeOH 100% Nhiều vết 5,86 Tổng cộng 12,275 Hiệu suất: 87,68%.
Ở phân đoạn LV10, với hệ dung môi CLF:MeOH = 90:10, sau khi thu hồi dung môi thu được chất bột màu trắng. Sau đó, rửa lại nhiều lần trong metanol và tiến hành sắc ký lớp mỏng hiện vết màu tím có Rf = 0,6 (CLF:MeOH = 80:20) khi dùng thuốc thử là H2SO4 10% trong EtOH.
Tổng khối lượng chất bột màu trắng là 125 mg.
Sau đó, tiến hành sắc ký lớp mỏng trên 3 hệ dung môi khác nhau và nhận thấy chỉ xuất hiện một vết tròn màu tím với thuốc hiện màu là dung dịch H2SO4 10%. Kết luận đây là chất sạch, kí hiệu EPT01.
(a) Hệ dung môi CLF : ACE (7:3) : Rf = 3,25 (b) Hệ dung môi ACE : EtOAc (5:5) : Rf = 0,49 (c) Hệ dung môi CLF : MeOH (8:2) : Rf = 0,62
(a) (b) (c)
Hình 8. Sắc kí lớp mỏng trên 3 hệ dung môi Hình 7. Chất EPT01
GHI CHÚ:
- CLF: Chlorofom - ACE: Aceton - MeOH: Methanol - EtOAc: Etyl acetat
V.5. Xác định các tính chất vật lí, cấu trúc của hợp chất và nhận danh
Hợp chất EPT01 thu được từ cao Etyl acetat có đặc điểm sau: Là dạng bột vô định hình, màu trắng, kết tinh trong methanol.
Sắc ký lớp mỏng silica gel giải ly bằng hệ dung môi CLF:MeOH (8:2), hiện hình bằng dung dịch acid H2SO4 10% cho một vết tròn màu tím có giá trị Rf = 0,62.
Điểm nóng chảy của hợp chất EPT01.
Bảng 6. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy của hợp chất EPT01
Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy của hợp chất EPT01 3-O- -D-glucosyl- brassicasterol Lần 1 Lần 2 Lần 3 276-278 0C 275 276 278 Trung bình = 276 0C Phổ IR
Phổ hồng ngoại của hợp chất EPT01 có các mũi hấp thu đặc trưng như sau:
Hình 9. TLC của EPT01 CLF:MeOH (8:2)
Bảng 7.Phổ hồng ngoại của hợp chất EPT01 νmax (KBr), (cm-1) Chú thích 3398,98 νOH 2958,05 2934,15 2868,30 νC-H 1641,35 νC=C 1024,03 1072,35 νC-O Phổ 1H-NMR (500 Hz, CDCl3 + CD3OD) ppm: 5,21 (1H, d, H-1’); 3,43 (1H, m, H-3); 5,00 (1H, t, H-6); 4,25 (1H, d, H-4); 0,86 (3H, s, H-19); 0,55 (3H, s, H- 18); 2,10 (2H, t, H-7); 4,88 (1H, d, H-22); 4,85 (1H, d, H-23); 1,83 (2H, m, H- 11,12); 0,50-0,90 (H của 6 nhóm metyl đặc trưng củ hợp chất sterol); 3,05-5,2 (H của nhóm –OH của đường)
Phổ 13C-NMR kết hợp với kỹ thuật DEPT của hợp chất EPT01 có các mũi hấp thu đặc trưng như sau:
Bảng 8. Phổ 13C–NMR kết hợp với kỹ thuật DEPT của hợp chất EPT01 Độ dich chuyển hóa học (,ppm) Loại carbon
100,87 C1’ của đường 140,08; 121,83 138,07; 129,34 >C5=C6< -C22=C23- 36,47; 41,96; 140,08 C tứ cấp 11,71; 11,83; 18,97; 20,68; 20,86; 18,62 C nhất cấp 20,78; 24,06; 25,02; 28,62; 29,32; 37,00; 38,42; 39,42; 61,52 C nhị cấp 31,62; 31,64; 40,21; 49,98; 51,02; 55,74; 56,61; 69,90; 73,30; 75,59; 76,20; 78,90; 100,78; 121,83; 129,06; 138,07 C tam cấp
Biện luận cấu trúc
Phổ IR (KBr, max, cm-1) cho biết:
- Tín hiệu hấp thu của nhóm O-H ở 3398.
- Tín hiệu thể hiện sự dao động của C-H ở 2868 – 2958. - Tín hiệu đặc trưng cho liên kết C=C ở 1641.
- Tín hiệu đặc trưng cho liên kết C-O ở 1024,03-1072,35. Phổ 1H-NMR, (500 Hz, ppm ,CDCl3 + CD3OD):
- 1 mũi ở 5,00 (t) là 1 proton tại liên kết đôi của C6. - 1 mũi ở 5,21 (d) là 1 proton tại vị trí C1’ của đường. - 1 mũi ở 3,43 (m) là 1 proton của C3.
- 2 mũi lần lượt ở 4,88 (d); 4,85 (d) là 1 proton tại liên kết đôi của C22 và C23. - 1 mũi ở 1,83 (m) là 2 proton của C11 và C12 đối xứng.
- 2 mũi lần lượt ở 0,55 (s); 0,86 (s) là 3 proton của C18 và C19. - 1 mũi ở 2.10 (t) là 1 proton của C7.
- Nhóm proton đặc trưng của đường trong vùng từ 3,05-5,20 ppm.
- 6 tín hiệu proton của methyl ở từ trường cao đặc trưng của hợp chất sterol trong vùng từ 0,55-0,90 ppm.
Phổ 13C-NMR kết hợp với DEPT 90, DEPT 135 ( ppm ,CDCl3 + CD3OD) cho thấy có 34 tín hiệu nguyên tử carbon, trong đó:
- Có 3 carbon tứ cấp: 36,47; 41,96; 140,08 - Có 9 carbon nhị cấp: 20,78; 24,06; 25,02; 28,62; 29,32; 37,00; 38,42; 39,42; 61,52. - Có 6 carbon nhất cấp: 11,71; 11,83; 18,97; 20,68; 20,86; 18,62. - Có 16 tam cấp: 31,62; 31,64; 40,21; 49,98; 51,02; 55,74; 56,61; 69,90; 73,30; 75,59; 76,20; 78,90; 100,78; 121,83; 129,06; 138,07.
- Có 2 tín hiệu ở 138,07 ppm và 129,34 ppm thuộc về liên kết đôi tại vị trí C22
và C23 đặc trưng của khung sườn stigmasterol.
- Có 2 tín hiệu ở 140,08 ppm và 121,83 ppm thuộc về liên kết đôi tại vị trí C5 và C6.
- Tại vị trí 100,87 ppm là carbon anomeric của phân tử đường glucoside, điều này phù hợp với phổ 1H-NMR có độ dịch chuyển hóa học là 5,21 (1H, d, H-1’). - Có 6 tín hiệu carbon gắn với nhóm hydroxyl methin và 1 nhóm hydroxyl methylen từ 61,52-100,78 ppm.
Bảng 9. So sánh phổ IR của EPT01 với 3-O- -D-glucosyl-brassicasterol
Hợp chất IR, νmax , (cm-1)
EPT01 3398,98 2934,15 1641,35 1024,03
3-O--D-glucosyl-
brassicasterol 3427 2948 1638 1063,34
Nhóm chức νOH νC-H νC=C νC-O
Bảng 10 . So sánh số liệu phổ NMR của hợp chất EPT01 với 3-O- -D-glucosyl-brassicasterol Vị trí carbon Loại carbon Hợp chất EPT01 (CDCl3 + CD3OD), 500 MHz 3-O- -D-glucosyl-