3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Quy trỡnh ỏp dụng cho thớ nghiệm ngoài ủồng ruộng a.ðất thí nghiệm
- Thớ nghiệm ủược bố trớ tại khu nhà lưới viện Sinh Học Nụng Nghiệp và khu thớ nghiệm Việt Trung trường ủại học Nụng Nghiệp Hà Nội.
- ðất cú thành phần cơ giới nhẹ, tơi xốp, cú pH = 6,5, chủ ủộng tưới tiờu. ðất ủược làm kỹ, sạch cỏ dại, san phẳng và lờn luống
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 37 b.Bố trớ thớ nghiệm ngoài ủồng ruộng
ðể theo dừi, ủỏnh giỏ cỏc ủặc ủiểm nụng sinh học của cỏc dũng ủậu tương ủột biến, thớ nghiệm ủồng ruộng ủược tiến hành trong 2 vụ: vụ Hố Thu 2011 và vụ Xuân Hè 2012.
Thí nghiệm vụ Hè Thu 2011(ngày gieo 29/7/2011) gồm tổng số 43 dòng thế hệ M4 (ðT12 gồm 16 dòng, ðT20 gồm 18 dòng và ðVN6 là 9 dũng. Thớ nghiệm ủược trồng trong khu nhà lưới Viện sinh học nụng nghiệp.
Thớ nghiệm ủược bố trớ theo sơ ủồ khối ngẫu nhiờn ủầy ủủ, 3 lần lặp lại, diện tích 2m2/ô thí nghiệm, 30 cây/m2, khoảng cách hàng 40 cm.
Thí nghiệm vụ Xuân Hè 2012(ngày gieo 15/2/2012) gồm tổng số 20 dòng thế hệ M5 (ðT12 gồm 6 dòng, ðT20 gồm 8 dòng và ðVN6 là 6 dòng.
Thớ nghiệm ủược trồng trong khu thớ nghiệm Việt Trung. Thớ nghiệm ủược bố trớ theo sơ ủồ khối ngẫu nhiờn ủầy ủủ, 3 lần lặp lại, diện tớch 2 m2/ụ thớ nghiệm, 30 cây/m2, khoảng cách hàng 40 cm
c.Phân bón
Lượng phân bón cho 1 ha: 5 tấn phân chuồng + 30kg N + 90kg P2O5 + 60kg K2O.
*Cách bón:
+ Bón lót: Toàn bộ phân chuồng và phân lân.
+ Bón thúc: 2 lần
Lần 1: Bón 1/2N + 1/2 K, khi cây có 2 – 3 lá thật.
Lần 2: Bón 1/2N + 1/2 K, trước khi cây ra hoa.
d.Chăm sóc
- Xới xáo: 2 lần
+ Lần 1: Khi cây có 2 – 3 lá thật, xới xáo kết hợp vun nhẹ.
+ Lần 2: Trước khi ra hoa, xới sõu 5 – 7 cm, vun cao ủể chống ủổ.
- Tưới nước: Nếu khô hạn thì tưới nước bổ sung.
- Phòng trừ sâu bệnh: Thường xuyên kiểm tra phòng trừ sâu bệnh kịp thời.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 38 e. Theo dừi, ủỏnh giỏ cỏc ủặc ủiểm nụng sinh học
Cỏc ủặc ủiểm nụng sinh học ủược ủỏnh giỏ theo TCN 10 tiờu chuẩn- 2006 BNN
Trong cả 2 vụ, các tính trạng theo dõi gồm:
- Thân mầm: Màu sắc thân mầm, theo dõi sau mọc mầm.
- Màu sắc lụng phủ, mức ủộ phõn cành.
- Lá: Màu sắc, hình dạng lá, theo dõi sau mọc mầm.
- Cây: Dạng cây, kiểu sinh trưởng, theo dõi khi cây ra hoa.
- Hoa: Màu sắc hoa theo dõi khi cây ra hoa.
- Hạt: Màu sắc vỏ hạt, rốn hạt, theo dõi khi quả chín.
- Thời gian sinh trưởng: Tớnh thời gian từ khi gieo ủến khi 90% số quả/cây chín
- ðếm số cành cấp 1/thân chính (cành).
- ðo chiều dài cành cấp 1/thân chính (cm).
- ðếm tổng số ủốt/thõn chớnh (ủốt).
- Chiều cao thõn chớnh (cm): ðo chiều dài thõn, tớnh từ ủốt thứ nhất ủến ủỉnh sinh trưởng
- Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất: Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất ủược xỏc ủịnh khi thu hoạch, bao gồm:
+ Số quả trờn cõy (quả/ cõy): tổng số quả trờn cõy khi thu hoạch ủược ủếm trờn từng cỏ thể. Tổng số quả ủược phõn chia thành quả chắc, số quả 1 hạt, 2 hạt, 3 hạt và tính tỉ lệ phần trăm từng loại:
Tổng số quả chắc
* Tỷ lệ quả chắc (%) =
Tổng số quả/cây x 100 Tổng số quả 1, 2 hay 3 hạt
* Tỷ lệ quả 1, 2 hay 3 hạt (%) =
Tổng số quả/cây x 100 + Khối lượng 1000 hạt (g)
+ Năng suất cá thể.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 39 3.2.2. Thí nghiệm trong phòng
3.2.2.1. Xỏc ủịnh hàm lượng Protein và Lipid
Cỏc dũng ủậu tương ủột biến ủỏnh giỏ trong vụ Hố Thu 2011 ủược xỏc ủịnh hàm lượng lipid và protein tổng số.
a. Xỏc ủịnh hàm lượng lipid
Hàm lượng lipid ủược xỏc ủịnh bằng phương phỏp Soxhlet. Hạt ủậu tương ủược sấy khụ ở 70oC ủến khối lượng khụng ủổi, nghiền mịn. Một lượng bột 0,05 (g) ủược ủưa vào ống effendorf 2ml, bổ sung 1,5 ml Petroleum ether, lắc ủều trong 10 phỳt rồi bảo quản mẫu ở4oC trong 24 giờ. Sau ủú dung dịch ủược li tõm với 12000 vũng/phỳt ở nhiệt ủộ 4oC trong 20 phỳt và loại bỏ dịch nổi. Quy trỡnh trờn ủược lặp lại 3 lần.
Hàm lượng lipid ủược tớnh bằng hiệu số khối lượng mẫu trước và sau khi chiết % khối lượng khô
% L =a b
a
− x 100%
Trong ủú:
%L: % của lipid
a: khối lượng mẫu trước khi chiết b: khối lượng mẫu sau khi chiết b. Xỏc ủịnh hàm lượng protein
Hàm lượng protein tan trong hạt ủậu tương ủược xỏc ủịnh theo phương pháp của Bradford (1976). Nguyên lý của phương pháp Bradford là dựa vào sự thay ủổi giữa 3 trạng thỏi tồn tại của Coomassie Blue G: cation (màu ủỏ), trung tớnh (màu xanh lỏ cõy) và anion (màu xanh da trời). Dưới ủiều kiện axit mạnh, Coomassie Blue G chủ yếu tồn tại ở trạng thái bị proton hóa do bị gắn 2 H+ hoặc cũn gọi là cation cú màu ủỏ. Ở trạng thỏi này Coomassie Blue G cú ủộ hấp thụ cực ủại ở bước súng 470 nm. Tuy nhiờn, khi gắn với protein, nú chuyển sang dạng ổn ủịnh ở trạng thỏi khụng bị proton húa (unprotonated)
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 40 hay còn gọi là anion và có màu xanh da trời. Trong quá trình phản ứng tạo phức với protein cú 2 dạng tương tỏc húa học xảy ra. Dạng cation (màu ủỏ) chuyển cỏc ủiện tử tự do của nú vào cỏc nhúm cú thể ion húa cú trong phõn tử protein dẫn ủến việc bộc lộ một số vựng kị nước trong phõn tử protein. Những vùng này sẽ phản ứng với vùng không phân cực của Coomassie G thông qua lực Van der Waals (giữa cỏc nhúm amin mang ủiện tớch dương và nhúm mang ủiện tớch õm của chất màu ở khoảng cỏch rất gần nhau). Liờn kết này ủồng thời cũng ủược giữ ổn ủịnh thờm bởi sự tương tỏc ion giữa 2 nhúm này. ðộ hấp thụ ỏnh sỏng của dung dịch chứa hỗn hợp protein và thuốc thử ủược ủo ở bước song 595 nm. ðộ hấp thụ ánh sáng tỉ lệ với hàm lượng protein có trong mẫu. Hàm lượng protein cú trong mẫu sẽ ủược xỏc ủịnh dựa vào ủường chuẩn albumin. ðể ủịnh lương protein theo phương phỏp Bradford, vật liệu và thiết bị sử dụng gồm: Dung dịch protein, albumin, cỏc dung dịch ủệm, mẫu cần xỏc ủịnh hàm lượng protein, dung dịch thuốc thử Bradford, mỏy ủo quang phổ, ống nghiệm và các hóa chất cần thiết. Các bước tiến hành cụ thể như sau:
Dung dịch gốc BSA (10mg/ml) ủược pha loóng thành cỏc dung dịch chuẩn cú nồng ủộ giảm dần như bảng dưới ủõy.
Bảng 3.1. Bảng pha loóng nồng ủộ dung dịch gốc
(*) Ống số 5: lấy 500 àl dung dịch từ ống số 4, bổ sung thờm 500 àl H2O (**) Ống số 6: lấy 500 àl dung dịch từ ống số 5, bổ sung thờm 500 àl H2O
Một dóy cỏc ống nghiệm sạch ủược chuẩn bị trước và ủỏnh số thứ tự.
Ống eppendorf Các hóa chất
1 2 3 4 5 6
H2O (àl) 420 450 460 950 * **
Nồng ủộ BSA gốc 10mg/ml (àl) 60 50 40 50 * **
Tổng thể tớch (àl) 480 500 500 1000 * **
Nồng ủộ cuối cựng (mg/ml) 1,25 1,0 0,8 0,5 0,25 0,125
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 41 Lần lượt cho vào các ống nghiệm các hóa chất theo bảng sau:
Bảng 3.2. Xõy dựng quy trỡnh ủường chuẩn Bradford
ðể tăng ủộ chớnh xỏc của ủường chuẩn, tương ứng với mỗi nồng ủộ chuẩn BSA nờn lặp lại 3 lần (sử dụng 3 lần nhắc lại hoặc 3 ống nghiệm cho 1 lần)
Sau khi trộn ủều, cỏc ống nghiệm ủược ủể trong tối ở nhiệt ủộ phũng khoảng 20 phỳt. ðo ủộ hấp thụ ỏnh sỏng ở bước súng 595 nm. Vẽ ủường chuẩn bằng Excel sử dụng kết quả ủo ủược, trục tung là giỏ trị OD, trục hoành là hàm lượng protein. Tuyến tính hóa thành phương trình tương quan giữa hàm lượng protein và OD. Cỏch tớnh hàm lượng của mẫu phõn tớch ủược tiến hành bằng cỏch ủối chiếu giỏ trị OD thu mẫu phõn tớch (Hỡnh 1).
Hỡnh 2. ðồ thị ủường chuẩn Bradford Ống nghiệm
1 2 3 4 5 6 7
(ð/chứng) BSA từ các dung dịch
chuẩn (àl)
100 100 100 100 100 100 100 ml H2O
Bradford 1X (ml) 5 5 5 5 5 5 5
H2O (àl) 0 0 0 0 0 0 100
Hàm lượng protein có trong mỗi ống nghiệm (mg)
1,25 1,0 0,8 0,5 0,25 0,125 0
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 42 3.2.3. đánh giá sai khác di truyền giữa các dòng
3.2.3.1. Tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số ủược tỏch chiết theo quy trỡnh của Doyle and Doyle (1992). Cỏc mẫu lỏ non trờn cõy ở cỏc dũng cú ủặc ủiểm hỡnh thỏi khỏc với giống gốc ủược chọn sao cho cỏc mẫu khụng bị cỏc bệnh do cỏc nấm, virus hay cỏc bệnh khỏc cú thể gõy ảnh hưởng ủến chất lượng của DNA mẫu cần phõn tớch sau này.
Quy trỡnh tỏch chiết DNA tổng số ủược tiến hành theo cỏc bước sau:
Bước 1: mỗi dũng lấy 5 lỏ non ở 5 cõy khỏc nhau giai ủoạn 2 – 3 lỏ thật.
Bước 2: Cắt khoảng 2cm mẫu lỏ cho vào cối, nhỏ 400àl dung dịch chiết tách DNA (CTAB 2%, Tris- HCl (PH= 0,8), EDTA, NaCl, PVP 1%), nghiền mẫu lỏ cho ủến khi dịch chiết chuyển sang màu xanh (dạng dịch ủồng thể).
Sau ủú chuyển sang ống effendorf 1,5ml ủược ủỏnh dấu tờn dũng..
Bước 3: ủ mẫu ở 650C trong 15 phút.
Bước 4: Ly tâm 12000 vòng/phút ở 40C trong 7 phút, hút dung dịch nổi phớa trờn sang ống effendorf 1,5ml mới ủược ủỏnh dấu cựng dũng.
Bước 5: Cho 500àl ethanol 96%, trộn ủều sau ủú ly tõm 12000 vòng/phút, trong 40C ở 5 phút. ðổ phần dung dịch phía trên, giữ lại phần kết tủa phớa dưới ủỏy ống effendorf.
Bước 6: Rửa kết tủa 3 lần bằng 500àl ethanol 70%, sau ủú ủể khụ ở 370C trong 30 phút.
Bước 7: Hũa tan kết tủa bằng 50àl dung dịch ủệm TE rồi bảo quản trong tủ lạnh -200C.
3.2.3.2. Kiểm tra ủộ tinh sạch của DNA tổng số
Sau khi tỏch chiết DNA, ủộ tinh sạch của DNA ủược kiểm tra bằng hai cách
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 43
*ðiện di trên gel agarose 1%
Mẫu DNA ủó ủược tỏch chiết, chạy ủiện di trờn gel agarose 1% ủể kiểm tra ủộ tinh sạch. Sau khi ủiện di xong, nhuộm sản phẩm DNA trong gel agarose bằng Ethidium bromide nồng ủộ 0,5àg/ml trong 15 phỳt. Quan sỏt và phõn tớch cỏc vệt băng bằng ủốn UV. Kết quả mẫu cú DNA tinh sạch khi cho vệt băng sáng rõ nét, ngược lại mẫu không có DNA khi không thấy xuất hiện vệt băng.
*Kiểm tra trên máy quang phổ kế
Nguyên tắc: dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm của cỏc base purin và pyrimidin. Giỏ trị mật ủộ quang ở bước súng 260 nm (A260) của cỏc mẫu cho phộp xỏc ủịnh hàm lượng acid nucleic trong mẫu dựa vào mối tương quan: một ủơn vị A260 tương ứng với nồng ủộ 50 ng/ful cho dung dịch DNA sợi ủụi
Hàm lượng DNA(ng/ àl ) = A260 x 50 x hệ số pha loóng
ðể kiểm tra ủộ tinh sạch của DNA tỏch chiết ủược, chỳng tụi tiến hành ủo thờm mật ủộ quang ở bước súng 280 (A280). ðộ tinh sạch ủược thể hiện ở tỉ số A260/A280. Một dung dịch acid nucleic ủược coi là sạch khi tỉ số A260/A280 dao ủộng trong khoảng 1,8- 2,0
3.2.3.3. Phản ứng RAPD - PCR
Phản ứng RAPD ủược tiến hành với cỏc mồi ngẫu nhiờn theo phương phỏp của Foolad và cụng sự (1990), sử dụng 10 lần mồi ngẫu nhiờn ủược tổng hợp bởi hãng Invitrogen, mỗi mồi dài 15 nucleoticde, thông tin về các trình tự cỏc mồi ủược trỡnh bày trong bảng 3.3
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 44 Bảng 3.3: Danh sỏch cỏc mồi RAPD ủược dựng trong nghiờn cứu
Tên mồi Trình tự mồi Tên mồi Trình tự mồi
OPB07 GGTGACGCAG OPM02 ACAACGCCTC
OPB17 AGGGAACGAG OPL11 ACGATGAGCC
OPC5 GATGACCGCC OPR03 ACACAGAGGG
OPC11 AAAGCTGCGG OPR11 GTAGCCGTCT
OPF05 CCGAATTCCC OPR12 ACAGGTGCGT
Phản ứng RAPD ủược thực hiện trong 25 àl dung dịch và sản phẩm RAPD ủược ủiện di trờn gel agarose 1,8%, nhuộm Ethylium biomide và chụp ảnh.
Thành phần và chu trỡnh nhiệt phản ứng RAPD ủược trỡnh bày trong bảng 3.4 và 3.5
Bảng 3.4 Thành phần hoá chất cho một phản ứng RAPD-PCR STT Thành phần phản ứng Thể tớch (àl)
1 Nước cất khử trùng 17
2 Dung dịch ủệm buffer (10x) 2,0
3 MgCl2 (2,5 mM) 2,0
4 dNTPs (2,5 mM) 1,2
5 Primer (10 àlM) 1,6
6 Taq - polynurase(5 U/àl) 0,4
7 DNA mẫu (10 ng) 0,8
Tổng 25
Phản ứng PCR- RAPD thực hiện trong máy PCR- Thermal Cycler PTC 100 theo chu kỳ nhiệt ủược trỡnh bày ở bảng 3.5
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 45 Bảng 3.5: Chu trình nhiệt phản ứng RAPD-PCR
Bước Phản ứng Nhiệt ủộ
(0C) Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 94 3 phút 1
2 Biến tính 92 1 phút
3 Gắn mồi 35 45 giây
4 Kéo dài chuỗi 72 1 phú
45
5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1
6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
*Phân tích số liệu RAPD
Dựa vào hỡnh ảnh ủiện di sản phẩm RAPD sự xuất hiện cỏc băng ủiện di ủược ước lượng và thống kờ cỏc băng ủiện di với từng mồi ở từng mẫu nghiờn cứu. sự xuất hiện hay khụng xuất hiện cỏc bằng ủiện di ủược tập hợp ủể phõn tớch số liệu theo nguyờn tắc số 1 – xuất hiện cỏc phõn ủoạn DNA và số 0 - khụng xuất hiện cỏc phõn ủoạn DNA. Cỏc số liệu này dược sử lý trờn mỏy tớnh theo phần mềm NSYS pc Version 2.0 (USA, 1998), ủể xỏc minh quan hệ di truyền của cỏc giống ủậu tương.