Chương II. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
3. Phương pháp thực hiện
3.1 Nội dung 1: Chế tạo dung dịch keo bạc nano/PVA bằng phương pháp bức xạ
3.1.1 Xác định liều chiếu xạ bão hòa của dung dịch Ag+/PVA theo nồng độ Ag+
Mục tiêu: xác định được liều chiếu xạ cần thiết để khử toàn bộ ion bạc Ag+ trong dung dịch bạc thành bạc kim loại Ago
Quy trình thí nghiệm:
Hòa tan 2g PVA trong 80 mL nước cất ở nhiệt độ 60-800C. Sau khi để dung dịch nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung 5 mL etanol vào và khuấy đều. Cân 0,17 g AgNO3 tương ứng với Ag+ nồng độ 10 mM và hòa tan trong 10 mL nước cất sau đó cho vào dung dịch PVA/etanol, khuấy đều. Thêm nước cất vào cho đủ 100 mL và cho dung dịch vào các ống nghiệm có nút vặn kín khí. Chiếu xạ tạo dung dịch keo bạc nano theo các liều chiếu xạ khác nhau trên nguồn gamma SVST/60-C0/B tại Trung tâm Nghiên cứu và Triển khai Công nghệ Bức xạ, liều xạ được đo bằng liều kế ethanol-chlorobenzene.
3.1.2.1 Đo phổ UV-vis dung dịch keo bạc
Các dung dịch sau khi chiếu xạ được để ổn định qua đêm. Pha loãng dung dịch keo bạc nano bằng nước đến nồng độ 0,1 mM. Đo phổ UV-vis trên máy quang phổ dùng cuvet thạch anh chiều dày 1 cm. Đo phổ hấp thụ đặc trưng dung dịch bạc nano trong dải bước sóng từ 200 đến 800 nm.
3.1.2.2 Chụp ảnh kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
Chụp ảnh TEM được tiến hành trên máy JEM1010, JEOL, Nhật Bản tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, Hà Nội. Kích thước và phân bố kích thước hạt bạc nano được tính từ ảnh TEM sử dụng phần mềm Photoshop CS2, version 9.0.
3.2 Nội dung 2: Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dung dịch keo bạc nano/PVA trong điều kiện in vitro
Mục đích: xác định nồng độ và kích thước của nano bạc/PVA tốt nhất để kháng khuẩn Vibrio parahaemolyticus
3.1.3 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ bạc/PVA lên sự phát triển của vi 1khuẩn V. parahaemolyticus điều kiện in vitro
Dung dịch sử dụng là dung dịch keo bạc nano nồng độ 10 mM được chiếu xạ ở liều bão hòa theo nội dung 1. Thí nghiệm được bố trí làm 4 lô và được lặp lại ba lần theo mô hình khối ngẫu nhiên theo sơ đồ như sau:
Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ bạc nano/PVA đến sự phát triển của vi khuẩn V. parahaemolyticus
Nghiệm thức Nồng độ bạc nano (ppm)
Đối chứng 0
ND 5 5
ND 10 10
ND 15 15
Khảo sát trên môi trường lỏng
Dùng bình tam giác loại 250 ml chứa 99 ml môi trường peptone kiềm cho V.
parahaemolyticus với các nồng độ bạc khác nhau: 0 (ĐC), 20, 40, 60, 80, 100 ppm.
Thêm vào 1ml huyền phù vi khuẩn sau khi tăng sinh đến nồng độ ~106 CFU/ml.
Cho các bình tam giác thí nghiệm được lắc trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút ttrong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Nồng độ V. Parahaemolyticus (CFU/ml) được xác định bằng phương pháp đo OD sau đó được trải trên môi trường thạch TCBS. Các đĩa được nuôi cấy vô trùng trong tủ ấm 37oC, sau 24 giờ đếm số khuẩn lạc hình thành.
Hiệu quả diệt khuẩn (à) được tớnh theo cụng thức sau:
à (%) = (No – Ni) x 100/No (1) Trong đó
No: số khuẩn lạc mẫu đối chứng (không có bạc nano)
Ni: số khuẩn lạc các mẫu có chứa bạc nano ở các nồng độ khác nhau Khảo sát trên môi trường rắn
Khả năng kháng khuẩn trên môi trường rắn của dung dịch keo bạc nano/PVA được thực hiện dựa trên phương pháp miêu tả bởi Kim và cs [13]. 0.1 ml huyền phù nuôi cấy V. parahaemolyticus ở mật độ ~106 CFU/ml được trải đều trên môi trường thạch rắn thích hợp có các nồng độ bạc nano/PVA lần lượt là 0, 5, 10, 15 g/
ml. Các đĩa được ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Khả năng kháng khuẩn của dung dịch keo bạc nano/PVA ở các nồng độ khác nhau được xác định theo công thức (1) 3.1.4 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của kích thước hạt nano bạc lên sự
phát triển của vi khuẩn V. Parahaemolyticus
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của hạt nano bạc ở 3 kích thước bạc khác nhau tương ứng với 3 nồng độ mol bạc và liều xạ bão hòa từ nội dung 1 như sau: 5 mM Ag+, 10 mM Ag+, 20 mM Ag+. Thí nghiệm được chia làm 4 lô tương ứng với 4 nghiệm thức, lặp lại 3 lần và được thực hiện theo sơ đồ và quy trình như sau:
phát triển vi khuẩn V. parahaemolyticus
Nghiệm thức Nồng độ mol bạc sử dụng (mM)
Đối chứng 0
KT 5 5
KT 10 10
KT 20 20
Khảo sát trên môi trường lỏng
Dùng bình tam giác loại 250 ml chứa 99 ml môi trường lỏng peptone kiềm cho V.
Parahaemolyticus có chứa dung dịch bạc/PVA ở nồng độ 5 mg/L có các kích thước hạt bạc nano khác nhau: 5 mM Ag+, 10 mM Ag+, 20 mM Ag+. Thêm vào 1ml dịch huyền phù vi sinh vật sau khi tăng sinh đến nồng độ ~106 CFU/ml. Các bình tam giác được lắc trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Nồng độ V. parahaemolyticus (CFU/ml) được xác định bằng phương pháp đo OD sau đó được trải trên môi trường thạch TCBS. Các đĩa được nuôi cấy vô trùng trong tủ ấm 37oC, sau 24 giờ đếm số khuẩn lạc hình thành.
Hiệu quả diệt khuẩn (à) được tớnh theo cụng thức (1) Khảo sát trên môi trường rắn
Hút 0.1 ml huyền phù nuôi cấy V. parahaemolyticus ở mật độ ~106 CFU/ml được trải đều trên các môi trường TCBS có chưa bạc nano/PVA ở ở nồng độ 5 mg/L có các kích thước hạt bạc nano khác nhau: 5 mM Ag+, 10 mM Ag+, 20 mM Ag+. Các đĩa được ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Khả năng kháng khuẩn của dung dịch keo bạc nano/PVA ở các kích thước bạc khác nhau được xác định dựa theo công thức (1)
2.2 Thiết lập quy trình chế tạo chế phẩm nano bạc/PVA bằng phương pháp chiếu xạ quy mô 100 lít/mẻ
Dựa vào các kết quả từ các thí nghiệm in vitro, tiến hành chế tạo dung dịch nano bạc/PVA với nồng độ AgNO3 và PVA thích hợp nhằm thu được bạc nano có kích thước hạt mong muốn và hiệu quả kháng khuẩn tối ưu.
Hình 2.1: Quy trình chế tạo chế phẩm nano bạc/PVA bằng phương pháp chiếu xạ quy mô lớn
Xác định hàm lượng bạc nano và kích thước hạt
Dung dịch nano bạc/PVA
Chiếu xạ gamma bằng nguồn xạ công nghiệp Hỗn hợp PVA, Ethanol và AgNO3
Dung dịch AgNO3
Ethanol
Để nguội đến nhiệt độ phòng
Nước cất ở 60 – 80oC PVA