Chương 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.3 Phương pháp xét nghiệm
Kiểm tra kháng thể kháng virus cúm gia cầm ở các mẫu máu sau khi lấy ở các thời điểm bằng phương pháp xét nghiệm HI
Phương pháp xét nghiệm HI (Cục Thú y, 2006)
Cách tiến hành phản ứng HI
Chuẩn bị hồng cầu gà 10% và 0,5%; chọn 2 - 3 con gà khỏe mạnh (từ những con không có bệnh cúm và không có tiêm phòng vaccine cúm gia cầm).
Lấy máu khoảng 4 - 5 ml có chất kháng đông (Alsever). Thêm một lượng tương đương dung dịch nước muối sinh lý vào phần máu vừa lấy, lắc đều. Ly tâm ở 2000 vòng trong 10 phút, loại bỏ phần nước phía trên và ly tâm lặp lại từ 2 - 3 lần.
Dùng Hematocrit để đo tỷ lệ hồng cầu sau khi đã được rửa sạch.
Pha hồng cầu 10% theo công thức C1V1=C2V2
Trong đó, C1: nồng độ hồng cầu gốc V1: thể tích hồng cầu gốc
C2: nồng độ hồng cầu cần pha V2: thể tích hồng cầu cần pha
Từ hồng cầu 10% pha hồng cầu 0,5% theo công thức trên để làm phản ứng.
Chuẩn độ kháng nguyên cúm gia cầm bằng phản ứng HA:
Cho 50 àl PBS vào hai hàng A và B của đĩa phản ứng 96 giếng.
Cho 50 àl khỏng nguyờn vào giếng A1 và B1.
Dùng micropipette trộn đều sau đó pha loãng dần từ giếng A1, B1 cho đến giếng A12, B12 với thể tớch là 50 àl, loại bỏ 50 àl dung dịch sau khi pha loóng đến giếng cuối cùng.
Thờm 50 àl hồng cầu gà 0,5% vào tất cả cỏc giếng, ủ ở nhiệt độ 4OC trong 45 phỳt.
Đọc kết quả: hiệu giá của kháng nguyên (một đơn vị kháng nguyên) là độ pha loãng cao nhất có 100% hồng cầu gà ngưng kết.
Bảng 3.2: Trình tự thực hiện phản ứng HA
Thành
phần 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
PBS(àl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
Kháng nguyên
(àl)
50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
Độ pha
loãng 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 1/4096 Hồng cầu
gà (àl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
Để ở nhiệt độ 4OC trong 45 phút
Chuẩn bị kháng nguyên 4 đơn vị để làm phản ứng HI
Giả sử hiệu giá của kháng nguyên một đơn vị là 1/256 thì kháng nguyên bốn đơn vị sẽ có hiệu giá là 1/64.
Pha kháng nguyên bốn đơn vị như sau: lấy 1 ml của kháng nguyên + 63 ml của nước muối sinh lý.
Tiến hành chuẩn độ lại kháng nguyên để xác định xem kháng nguyên mới pha chuẩn bị làm phản ứng HI có đúng là kháng nguyên bốn đơn vị chưa.
Cách tiến hành tương tự như phản ứng HA và giếng ngưng kết cao nhất là giếng thứ hai, sau đó tiến hành phản ứng HI.
Bảng 3.3: Chuẩn độ ngược kiểm tra kháng nguyên 4 HA (Nguồn: Tiêu chuẩn 10 TCN (2005) – Quy trình chẩn đoán bệnh cúm gia cầm)
Chuẩn bị mẫu huyết thanh làm phản ứng HI
Mẫu huyết thanh sau khi chắt xong tiến hành xử lý nhiệt ở 56oC trong 30 phút.
Sử dụng hồng cầu gà 10% để hấp thụ những yếu tố làm ức chế quá trình thực hiện phản ứng HI, cách thực hiện như sau:
Cho 90 àl PBS vào tất cả cỏc giếng của đĩa phản ứng.
Cho 30 àl mẫu huyết thanh đó xử lý nhiệt vào đĩa phản ứng.
Cho 10 àl hồng cầu gà 10% vào tất cả cỏc giếng của đĩa phản ứng.
Ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu HI
Nguyên lý: một số loại virus như virus cúm gia cầm, virus Newcastle có đặc tính gây ngưng kết hồng cầu ở một số loài gia súc, gia cầm. khi gặp kháng thể đặc hiệu tương ứng thì virus sẽ bị kháng thể trung hòa, không còn virus để tiếp xúc với hồng cầu, do đó kháng thể đã ức chế gây ngưng kết hồng cầu của virus. Ngược lại, nếu virus không gặp kháng thể đặc hiệu tương ứng, virus sẽ không bị trung hòa bởi kháng thể và sẽ gây ngưng kết hồng cầu.
Tiến hành phản ứng HI:
Cho 25 àl PBS vào tất cả cỏc giếng của đĩa phản ứng 96 giếng.
Cho 25 àl huyết thanh đó được hấp phụ vào giếng thứ nhất, trộn đều, hỳt 25 àl cho sang giếng thứ hai, làm tiếp tục như vậy cho đến giếng thứ 9, hỳt bỏ 25 àl.
Cho 25 àl khỏng nguyờn bốn đơn vị vào tất cả cỏc giếng của đĩa phản ứng, lắc đều, đều ở 4OC trong 30 phút cho kháng thể hiện diện trong huyết thanh liên kết với kháng nguyên.
Cho vào mỗi giếng 25 àl hồng cầu gà 0,5%, lắc đều. Sau đú để ở 4OC trong 45 phỳt cho đến khi hồng cầu trong giếng đối chứng tụ lại thành cụm tròn nhỏ ở đáy giếng.
Thực hiện phản ứng đối chứng: giếng thứ 10 và 11 để làm đối chứng âm và đối chứng dương, thực hiện tương tự như các mẫu huyết thanh kiểm tra nhưng thay vào đó bằng huyết thanh âm tính và dương tính chuẩn. Giếng thứ 12 làm đối chứng hồng cầu: 25 àl dung dịch PBS và 25 àl hồng cầu gà 0,5%.
Bảng 3.4: Trình tự thực hiện phản ứng HI Thành
phần 1 2 3 4 5 6 7 8 9
10 (ĐCÂ)
11 (ĐCD)
12 (ĐCHC)
PBS(àl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 50
Huyết
thanh(àl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Độ pha
loãng 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 Kháng
nguyên (àl)
25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
Để ở 4OC trong 30 phút Hồng
cầu gà (àl)
50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
Để ở 4OC trong 30 phút
Cho 25àl PBS vào tất cả cỏc giếng của đĩa phản ứng 96 giếng.
Cho 25 àl huyết thanh đó được hấp phụ vào cỏc giếng của hai hàng A và B của đĩa phản ứng (hàng A làm đối chứng huyết thanh, hàng B làm phản ứng).
Dùng micropipette pha loãng mẫu huyết thanh bắt đầu từ hàng H với thể tích là 25 àl, loại bỏ 25 àl sau khi pha loóng đến hàng cuối cựng của đĩa phản ứng.
Cho 25 àl khỏng nguyờn bốn đơn vị vào tất cả cỏc giếng của đĩa phản ứng, trừ giếng đối chứng huyết thanh (hàng A).
Ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
Cho 50 àl hồng cầu gà 0,5% vào tất cả cỏc giếng của đĩa phản ứng.
Ủ ở nhiệt độ 4OC trong 45 phút tiến hành đọc kết quả.
Đọc kết quả:
Phản ứng dương tính: khi hồng cầu tụ thành chấm đỏ ở dưới đáy giếng, giếng đối
thanh là độ pha loãng cao nhất của mẫu huyết thanh có hiện tượng ức chế ngưng kết hồng cầu gà 100%.
Phản ứng âm tính: hồng cầu xuất hiện từng cụm ngưng kết ở đáy giếng.
Kết luận: Mẫu huyết thanh được xem là có kháng thể kháng virus cúm gia cầm (dương tính) khi có hiệu giá kháng thể ≥ 1/8 Subtype dương tính tùy thuộc vào kháng nguyên sử dụng trong phản ứng.
Tiêu chí đánh giá
Hiệu giá HI ≥ 1/16 (4log2) được coi là hiệu giá bảo hộ của cá thể gia cầm; đàn gia cầm được bảo hộ là đàn có ≥ 70% số cá thể có hiệu giá HI ≥ 1/16 (4log2). Theo quy định của Cục Thú Y, Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn tại công văn số 1361/ CTY- DT ngày 02/12/2005 của Cục Thú Y về Hướng dẫn giám sát sau tiêm phòng vaccine cúm gia cầm thể độc lực cao giai đoạn I: 2005- 2006.