Sau quá trình chế tạo hạt chitosan gắn PEG, chúng tôi tiến hành chế tạo hạt nano chitosan gắn PEG. Phương pháp tạo phức giữa các chất cao phân tử mang điện tích trái dấu để tạo thành các chitosan dạng hạt được ứng dụng nhiều do quy trình này khá đơn giản và dễ thực hiện. Hơn nữa, đây là phương pháp tạo liên kết ngang vật lý (physical cross-linking) hình thành do tương tác tĩnh điện giữa các điện tích trái dấu, thay vì tạo liên kết ngang hóa học, do đó tránh được độc tính mà các tác nhân hóa học gây ra.
TPP là một polyanion, chất này có thể tương tác với cation chitosan bởi lực tương tác tính điện.
Quy trình tổng hợp hạt nano chitosan đã được trình bày trong chương 2. Để đánh giá sự tổng hợp hạt nano chitosan gắn PEG, chúng tôi tiến hành phương pháp đo phổ hồng ngoại FTIR.
Hình 3.3: Phổ hồng ngoại (FTIR) của chitosan, PEG và chitosan sau khi gắn PEG
Luận Văn Thạc Sĩ 37 CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến 3.2.1 Kết quả chế tạo hạt nano chitosan gắn PEG qua phổ hồng ngoại FTIR
Thông qua việc phân tích phổ hồng ngoại FTIR, chúng tôi nhận thấy rằng ngoài các đỉnh phổ đặc trưng cho chitosan như 1560cm-1 và 1650cm-1 của dao động nhóm amin(- NH2), đỉnh phổ dao động đặc trưng của PEG như 2878cm-1 của dao động nhóm (C-H) và 1120cm-1 của dao động (C=O) thì còn có một đỉnh phổ khác xuất hiện là 1164cm-1 của nhóm P=O đặc trưng cho dao động của TPP. Tuy đỉnh phổ này khá ngắn nhưng cũng đủ để chúng tôi khẳng định được rằng có sự tạo liên kết ngang giữa ion chitosan với ion TPP.
Sau khi đo phổ hồng ngoại chứng tỏ được việc tạo thành liên kết ngang giữa chitosan gắn PEG với TPP. Hay nói cách khác đã có sự tạo thành hạt nano chitosan gắn PEG.
Tuy nhiên, chúng tôi vẫn chưa tìm ra tỉ lệ thích hợp giữa chitosan gắn PEG và TPP để tạo ra hạt nano được như mong muốn. Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện như sau:
Hình 3.4: Phổ hồng ngoại FTIR của TPP và hạt chitosan gắn PEG-TPP
3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chitosan gắn PEG
Chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ của chitosan gắn PEG đến kích thước hạt nano chitosan tạo thành. Ở đây, chúng tôi giữ nguyên nồng độ của TPP pha vào ban đầu, mà chỉ thay đổi nồng độ của chitosan gắn PEG theo khối lượng (w/w), phản ứng được thực hiện theo quy trình đã nêu ở chương 2 với nồng độ pH ổn định pha trước. Tỉ lệ chitosan gắn PEG: TPP được thay đổi như sau 1:1, 2:1 và 4:1. Sau khi thực hiện xong thí nghiệm, chúng tôi tiến hành đo kích thước hạt bằng máy kích thước hạt(DLS) để xác định hạt nằm trong khoảng bao nhiêu.
Dựa vào hình kích thước hạt ở 3 tỉ lệ nêu trên, chúng tôi nhận thấy rằng ở tỉ lệ 1:1 thì kích thước hạt phân bố trong khoảng gần 100 nm. Trong khi đó đối với tỉ lệ 2:1 và 4:1 thì sự phân bố kích thước hạt đã có sự thay đổi, hạt phân bố theo kích thước lớn dần.
Đổi với tỉ lệ 2:1 thì kích thước hạt phân bố trong khoảng từ dưới 100nm đến gần 6000nm. Đối với tỉ lệ 4:1 thì kích thước hạt đã tăng lên nhiều, hạt phân trong khoảng 1000-6000nm. Kích thước hạt lớn dần khi có sự thay đổi nồng độ của chitosan gắn PEG so với TPP theo tỉ lệ về khối lượng. Điều này có thể giải thích rằng, khi ta tăng nồng độ chitosan gắn PEG lên nhưng vẫn thay đổi lượng TPP như ban đầu, thì TPP sẽ không đủ để có thể tao liên kết ngang với chitosan gắn PEG nên hạt nano tạo ra có xu hướng tụ lại, làm cho kích thước hạt càng tăng lên.
Hình 3.5: Sự phân bố kích thước hạt theo tỉ lệ chitosan gắn PEG: TPP là 1:1 (w/w)
Luận Văn Thạc Sĩ 39 CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến
Mặt khác, nhìn từ hình của 3 tỉ lệ đã khảo sát, chúng tôi nhận thấy rằng khi tỉ lệ của chitosan gắn PEG càng tăng thì màu của dung dịch pha được càng chuyển sang màu trắng đục. Điều này chứng tỏ rằng, kích thước hạt tăng lên khi có sự thay đổi tỉ lệ của chitosan.
Hình 3.6: Sự phân bố kích thước hạt theo tỉ lệ chitosan gắn PEG: TPP là 2:1 (w/w)
Hình 3.7: Sự phân bố kích thước hạt theo tỉ lệ chitosan gắn PEG: TPP là 4:1 (w/w)
Từ kết quả thu được sau khi đo DLS, chúng tôi nhận thấy rằng tỉ lệ phù hợp để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo là 1:1.
3.2.3 Khảo sát độ ổn định của hạt nano chitosan
Sau khi tìm được tỉ lệ thích hợp để tiến hành các bước khảo sát tiếp theo. Chúng tôi tiến hành khảo sát sự ổn định của hạt nano chitosan gắn PEG pha theo tỉ lệ 1:1 như đã phân tích ở trên.
Hình 3.8: Ảnh của các dung dịch pha theo tỉ lệ chitosan gắn PEG:TPP lần lượt là 1:1, 2:1, 4:1
(a) (b)
Luận Văn Thạc Sĩ 41 CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến
Theo dõi sự thay đổi từ trực quan, chúng tôi nhận thấy rằng, màu sắc của mẫu pha theo tỉ lệ 1:1(w/w) hầu như không thay đổi theo thời gian.
Hình 3.9: Ảnh kích thước hạt của hạt nano chitosan gắn PEG theo thời gian theo bảng 3.1
Bảng 3.1: Kết quả sự ổn định của kích thước hạt theo thời gian
Thời gian 1 ngày 2 ngày 1 tuần 2 tuần 3 tuần 4 tuần
Kích thước hạt(nm) 107 107 105 106 106 108
(c) (d)
(e) (f)
Sau khi đã tìm được tỉ lệ thích hợp và đã khảo sát độ ổn định của hạt theo thời gian, chúng tôi đã tiến hành chế tạo hạt nano chitosan gắn PEG bọc insulin.