VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương phỏp ủiều tra:
- Sử dụng phương phỏp ủiều tra hồi quy, kết hợp với một số phương pháp nghiên cứu dịch tễ khác như: mô tả, phân tích và tổng hợp.
2.4.2. Phương phỏp phõn lập vi khuẩn gõy bệnh và xỏc ủịnh cỏc yếu tố gõy bệnh của cỏc chủng vi khuẩn phõn lập ủược:
- ðược xỏc ủịnh theo quy trỡnh chuẩn của Bộ mụn Vi trựng, Viện Thỳ Y Quốc gia
2.4.3. Phương phỏp kiểm tra an toàn và hiệu lực vacxin trờn ủộng vật thớ nghiệm:
- ðược tiến hành và ủỏnh giỏ dựa trờn "Quy trỡnh kiểm nghiệm vacxin dùng trong thú y" do Trung tâm kiểm nghiệm thuốc Thú y Nhà nước ban hành (1994)
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………31
- Kiểm tra an toàn trên chuột bạch: chọn 15 chuột khoẻ mạnh tiêm vacxin với liều 0,2 hoặc 0,5 ml/con (gấp 2,5 lần miễn dịch). Theo dõi 10 ngày. Chuột ủược thử an toàn ủều phải sống khoẻ mạnh qua thời gian 10 ngày theo dõi, không con nào có biểu hiện phản ứng sau khi tiêm.
- Kiểm tra hiệu lực trên chuột bạch: mỗi lô vacxin chọn 10 chuột khoẻ mạnh, mỗi con tiêm 0,2 ml vacxin vào dưới da. Sau 21 ngày, chuột tiêm miễn dịch cựng với 5 chuột ủối chứng ủem thử thỏch với chủng cường ủộc liều 10LD50 cho 1 chuột. Toàn bộ chuột ủược theo dừi 10 ngày. Ở lụ thớ nghiệm, yờu cầu là ớt nhất phải cú 70- 90% số chuột ủược bảo hộ. Trong khi ủú, cỏc chuột ủối chứng sau khi cụng cường ủộc ủều chết 100% trong vũng 24 - 48 giờ và ủều phõn lập ủược vi khuẩn E. coli từ mỏu tim cỏc chuột chết.
2.4.4. Phương phỏp tiờm thử nghiệm trờn lợn ủể ủỏnh giỏ hiệu lực phũng bệnh của vacxin: theo phương pháp phân lô
Chọn những lợn khoẻ mạnh cú cựng ủộ tuổi (14 -15 ngày tuổi) trong cựng 1 cơ sở chăn nuụi, chia làm 2 lụ: Lụ thớ nghiệm và lụ ủối chứng.
+ Lụ thớ nghiệm 1: Tiờm cho lợn vacxin ủược chế tạo tại Bộ mụn Vi trùng, Viện Thú y 2 lần: lần 1 lúc 14 ngày tuổi và lần 2 lúc 21 ngày tuổi. Liều 1 ml/con/lần vào dưới da gốc tai.
+ Lụ ủối chứng: Khụng tiờm vacxin
Trước và sau khi tiêm vacxin, tiến hành lấy máu ở vịnh tĩnh mạch cổ của cỏc lợn tại cỏc thời ủiểm: 0 ngày, 7 ngày, 1 thỏng, 2 thỏng, 3 thỏng, 4 thỏng, 5 thỏng và 6 thỏng ủể thực hiện phản ứng ngưng kết giỏn tiếp hồng cầu, xỏc ủịnh hiệu giỏ khỏng thể cú trong huyết thanh. ðồng thời, theo dừi cỏc phản ứng của lợn sau khi tiêm.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………32
2.4.5. Phương phỏp xỏc ủịnh hàm lượng khỏng thể trong mỏu của lợn bằng phản ứng ngưng kết gián tiếp hồng cầu:
- Theo quy trình của JICA chuyển giao cho Viện Thú Y
* Chuẩn bị:
- Khỏng nguyờn: là cỏc chủng vi khuẩn ủó sử dụng ủể chế vacxin ủược nuụi cấy trờn mụi trường thạch mỏu ở 37oC qua ủờm và tiến hành xử lý ở 100oC trong vũng 1 giờ. Hỗn hợp cỏc chủng vi khuẩn ủược tiến hành trộn lẫn với nhau theo cỏc tỷ lệ tương ủương và hũa trở lại vào dung dịch PBS vụ trựng theo tỷ lệ cứ 1 ủĩa thạch mỏu với 2-4 ml dung dịch PBS.
- Hồng cầu cừu ủược lấy trong ngày trong dung dịch cú chứa chất chống ủụng Alsever. Ly tõm ở 2500 rpm trong 10 phỳt và tiến hành rửa 3 lần bằng dung dịch PBS (pH=7.2). Sau lần rửa cuối cựng, hồng cầu cừu ủó ủược pha loóng 25% ủược tiến hành trộn với 1 thể tớch tương ủương dung dịch Glutaraldehyde 1%. Lắc nhẹ ở 4oC trong vòng 30 phút.
- Khỏng nguyờn và hồng cầu cừu 10% ủó qua xử lý ủược trộn với nhau theo 1 thể tớch tương ủương. Ủ ở tủ ấm 37oC trong 1,5-2 giờ.
- Huyết thanh lợn: Pha loóng ở nồng ủộ 1/10
* Tiến hành phản ứng:
- Phản ứng ủược thực hiện trờn ủĩa nhựa 96 lỗ, ủỏy trũn - Cách tiến hành như sau:
+ Cho vào tất cả cỏc giếng 25 àl dung dịch PBS
+ Nhỏ 25 àl huyết thanh ủó ủược pha loóng ở nồng ủộ 1/10 vào giếng thứ 1, trộn ủều, chuyển 25 àl từ giếng thứ 1 sang giếng 2 và cứ làm như vậy ủến giếng thứ 7 thỡ bỏ ủi 25 àl. ðộ pha loóng huyết thanh của cỏc giếng sẽ lần
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………33
lượt là 1/20, 1/40, 1/80, ... 1/1280. Riêng giếng cuối cùng chỉ có dung dịch PBS và khụng cú huyết thanh, dựng ủể làm ủối chứng.
+ Cuối cựng, nhỏ vào tất cả cỏc giếng 25 àl hỗn hợp khỏng nguyờn- hồng cầu cừu. Lắc nhẹ. ðể yờn tĩnh ở nhiệt ủộ phũng. Sau 30 phỳt, ủọc kết quả lần 1 và ủọc lại lần 2 sau 4 giờ.
Số thứ tự giống Nguyên liệu
1 2 3 4 5 6 7 ðC
PBS (àl) 25 25 25 25 25 25 25 25
Huyết thanh
(àl) 25
ðộ pha loãng huyết
thanh
1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280
Hỗn hợp KN-Hồng
cầu cừu
25 25 25 25 25 25 25
* Cỏch ủỏnh giỏ kết quả :
- Phản ứng dương tớnh: hồng cầu dàn ủều ở dưới ủỏy giếng như hỡnh chiếc ô lộn ngược, chứng tỏ kháng nguyên và kháng thể là tương ứng với nhau nờn ủó làm ngưng kết hồng cầu.
- Phản ứng õm tớnh: Hồng cầu lắng xuống ủỏy thành cục trũn ủỏ, chứng tỏ kháng thể không tương ứng với kháng nguyên.
2.4.6. Phương phỏp ủỏnh giỏ ủộ an toàn và hiệu quả của vacxin phũng bệnh phự ủầu tại 1 số trại chăn nuụi thuộc tỉnh Hà Tõy:
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………34
Vacxin ủược tiến hành tiờm cho cỏc lợn trong ủộ tuổi cần phũng bệnh nuụi tại một số trại chăn nuụi thuộc 5 huyện của tỉnh Hà Tõy. Theo dừi ủộ an toàn của vacxin bằng phương phỏp theo dừi trực tiếp và ủỏnh giỏ hiệu quả phòng bệnh của vacxin bằng phương pháp so sánh tỷ lệ lợn có biểu hiện triệu chứng lõm sàng nghi bệnh phự ủầu, và tỷ lệ lợn chết do bệnh giữa lụ thớ nghiệm là trại ủược tiờm vacxin và lụ ủối chứng là trại khụng tiờm vacxin trong thời gian 6 tháng.
2.4.7. Phương pháp xử lý số liệu:
Số liệu thu ủược trong cỏc thớ nghiệm ủược xử lý theo phương phỏp thống kờ sinh vật học và sử dụng phần mềm Excel ủể xử lý số liệu trờn mỏy tính.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………35