NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu

2.1.1. Nguyên liệu chính

Đối tượng nghiên cứu là các chủng vi sinh vật thuần khiết được phân lập ở màng các nguồn nguyên liệu nhờ quá trình lên men giấm từ: bia, rượu vang, dịch hoa quả, giấm làm theo phương pháp cổ truyền.

Động vật thử nghiệm: thỏ nhà khỏe mạnh trọng lượng từ 1,4 - 1,6kg.

2.1.2. Hóa chất và thiết bị 2.1.2.1. Hóa chất

Các hóa chất thông dụng: glucozơ (C6H12O6), cao nấm men, cao thịt, pepton, axit axetic, rượu etylic, NaOH, MgSO4.7H2O, (NH4)2SO4, KH2PO4, K2HPO4, CaCO3, agar - agar, phenolphtalein, thuốc nhuộm tím gentian, dung dịch fucshin, dung dịch lugol…. Tất cả các hóa chất đều tinh sạch ở mức phân tích.

Nước dừa nguyên chất, nước mía ép nguyên chất, dầu mù u. (Thành phẩm mua ở hiệu thuốc Viện bỏng Quốc gia).

2.1.2.2. Thiết bị

Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức), nồi hấp Tommy (Nhật), máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh) , máy li tâm Sorvall (Mỹ), micropipet Jinson (Pháp) các loại từ 20l - 10ml, máy so màu UV - vis (Nhật), máy đo pH (MP 200 R - Thụy Sĩ), cân (Precisa XT 320 M - Thụy Sĩ) máy cất nước hai lần (Hamilton - Anh) , kính hiển vi quang học Carl Zeiss (Đức): Axioskop 40, hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, la men, đèn cồn… và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.

2.1.3. Các loại môi trường

2.1.3.1. Môi trường phân lập vi khuẩn giấm (MT1) [2] [4]

Glucozơ: 20g (NH4)2SO4: 3g

KH2PO4: 2g MgSO4.7H2O: 2g

CaCO3: 7g Agar agar: 20g

Axit axetic: 2%

(Bổ sung sau khử trùng)

Rượu etylic: 2%

(Bổ sung sau khử trùng) Nước máy: 1000ml

2.1.3.2. Môi trường nhân giống cơ bản (MT2) [2] [4]

Glucozơ: 20g (NH4)2SO4:3g KH2PO4: 2g MgSO4.7H2O: 2g

Pepton: 6g Axit axetic: 2% (Bổ sung sau khử trùng) Nước máy: 1000ml Rượu etylic: 2% (Bổ sung sau khử trùng)

2.1.3.3. Các môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng [6]

TT Thành phần MT3 MT4 MT5 MT6

1 Glucozơ 20g 20g 0g 20g

2 (NH4)2SO4 3 3 5 4

3 KH2PO4 2 2 2 1

4 MgSO4.7H2O 2 2 0 0

5 Axit axetic 2% 2% 5ml 2,5ml

6 Rượu etylic 2% 2% 0 0

7 Cao nấm men 0 5g 3g 0

8 Pepton 0 6g 2g 0

9 Nước mía ép 0 0 200ml 0

10 Nước dừa 0 0 0 1000ml

11 Nước máy 1000ml 1000ml 800ml 0

2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp vi sinh

2.2.1.1. Phân lập chủng vi khuẩn Acetobacter (vi khuẩn giấm) theo phương pháp của Vinogradski [2] [4]

Để có được chủng vi khuẩn Acetobacter, chúng tôi tiến hành quá trình phân lập vi khẩn từ các nguồn nguyên liệu: bia, rượu vang, dịch hoa quả theo phương pháp của Vinogradski. Trước hết thực hiện quá trình lên men giấm từ các nguồn nguyên liệu trên. Vi khuẩn axetic là loài vi khuẩn hiếu khí nên chúng phát triển trên môi trường lỏng tạo thành một lớp màng dày, dai, màu trắng - màng này là tập hợp các vi khuẩn axetic và màng cellulose, lấy màng đó đưa vào môi trường số 2 ( môi trường số 2 (MT2) đã được hấp khử trùng ở 1atm, nhiệt độ 1210C, thời gian là 15 phút, để nguội, bổ sung rượu và axit sau khi khử trùng). Sau khi thả màng vào môi trường số 2, giữ trong tủ ấm 28 - 300C trong thời gian 4 - 7 ngày trên bề mặt môi trường xuất hiện một lớp màng mới. Từ màng này tiến hành phân lập để thu nhận vi khuẩn Acetobacter.

Phương pháp pha loãng của Pasteur: Chuẩn bị nước cất 2 lần, dùng 10 ống nghiệm định mức 10ml (đậy nút bông, đã được sấy khử trùng) cho 9ml nước cất đã chuẩn bị ở trên vào; đưa vào hấp khử trùng ở 1210C, áp lực là 1 atm, thời gian 15 phút (các thao tác làm trong box cấy vô trùng). Lấy mẫu màng từ các nguồn nguyên liệu đưa vào ống nghiệm đã chứa sẵn nước cất thanh trùng, đem vontex đều, lấy pipét vô trùng hút 1ml dịch từ ống nghiệm này cho vào ống nghiệm thứ nhất, đậy nút bông lại rồi lắc đều bằng cách vontex trong 5 phút sẽ thu được ống nghiệm chứa dịch pha loãng ở mức 10-1. Tiếp theo, lại hút 1ml dịch ở ống có độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm thứ hai vontex đều thu được dịch pha loãng ở mức 10-2. Với các thao tác lặp

lại như trên, ta sẽ thu được dịch pha loãng ở các mức độ: 10-1; 10-2; 10-3; ...;

10-10. Mức độ pha loãng quyết định bởi số lượng vi sinh vật, căn cứ vào số lượng vi khuẩn có trong mẫu, chúng tôi chọn mẫu ở độ pha loãng 10-4 - 10-7 để tiến hành phân lập trên môi trường thạch đĩa.

Phương pháp thạch đĩa: chuẩn bị môi trường 1 hấp khử trùng ở 1210C và 1atm, để nguội, bổ sung rượu và axit; tiếp theo đổ vào hộp petri đã vô trùng, để nguội khi đó bề mặt thạch sẽ đông lại. Dùng pipet vô trùng hút 100l dịch màng đã chuẩn bị ở trên (có độ pha loãng 10-4-10-7) nhỏ vào lên trên bề mặt thạch, dùng que trang dàn đều các tế bào vi khuẩn lên trên khắp bề mặt thạch.

Bao gói cẩn thận, cất trong tủ ấm ở 28 - 300C, sau 3 - 4 ngày lấy ra quan sát khuẩn lạc (các đặc điểm về hình dạng kích thước, màu sắc, độ trơn bóng, viền mép quanh khuẩn lạc) và vòng phân giải CaCO3 quanh khuẩn lạc. Dựa trên đặc điểm của khuẩn lạc thu được đối chiếu so sánh với đặc điểm của khuẩn lạc Acetobacter chọn ra những khuẩn lạc của vi khuẩn axetic để tiến hành các bước tiếp theo

Chú ý: tất cả các dụng cụ thí nghiệm, dung dịch và môi trường nuôi cấy trước khi sử dụng đều phải hoàn toàn vô trùng, các thao tác thí nghiệm đều được làm trong box cấy vô trùng.

2.2.1.2. Tuyển chọn các chủng Acetobacter cho màng cellulose theo phương pháp Graxinop [1] [2][4]

Trước khi tuyển chọn cần phải nhân giống các chủng vi khuẩn: môi trường 1 sau khi vô trùng đổ vào ống nghiệm, đậy nút bông, đặt nghiêng, để nguội. Dùng que cấy đầu tròn (đã được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn) gợt lấy một khuẩn lạc riêng rẽ cấy vào một ống thạch nghiêng theo đường ziczac, với mỗi khuẩn lạc sẽ được mã hoá bằng một ký hiệu riêng. Để vào tủ ấm 4 - 6 ngày, các vi khuẩn sẽ phát triển theo đường cấy.

Sau đó, tuyển chọn các chủng vi khuẩn Acetobacter trong môi trường oxi hoá (MT2) để kiểm tra khả năng tạo màng. Cho 1ml nước cất thanh trùng vào ống giống (ống nghiệm thạch nghiêng chứa các tế bào vi khuẩn đã được hoạt hoá bằng cách cấy chuyển ống giống được bảo quản trong tủ lạnh sang ống thạch nghiêng khác, khi tế bào vi khuẩn đã phát triển theo đường cấy sẽ được sử dụng để kiểm tra khả năng tạo màng), dùng que cấy vô trùng gợt các tế bào ra đường cấy hoà tan vào nước, dùng pipet vô trùng hút dịch vi khuẩn đưa sang môi trường oxi hoá để thử khả năng tạo màng. Tiến hành tuyển chọn liên tiếp 3 lần, chúng tôi thu được chủng có khả năng tạo màng tốt nhất để dùng cho những nghiên cứu tiếp theo.

Để giữ giống cần cấy chuyển giống theo chu kỳ 2 tháng 1 lần.

2.2.1.3. Tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum thuần khiết a). Phương pháp quan sát tế bào [2] [4]

Sau quá trình sơ tuyển, chúng tôi đã chọn ra một số chủng, các chủng này cần tiếp tục được xác định bằng phương pháp quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi quang học để xác định xem có đúng là chủng vi khuẩn cần tìm không. Quan sát hình dạng tế bào khi nhuộm Gram: phương pháp này gồm các bước sau:

- Rửa sạch lam kính bằng NaOH sau đó rửa bằng HCl hoặc H2SO4, rửa lại bằng cồn hoặc nước cất và lau khô.

- Nhỏ một giọt nước vô trùng lên lam kính, dùng que cấy lấy một ít màng trắng hoặc dịch nuôi cấy hoặc giống vi khuẩn hoà vào giọt nước. Cố định vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn (cách đèn cồn 10 - 15 cm).

- Đặt lên trên vêt bôi miếng giấy lọc, nhỏ dung dịch tím Gentian, giữ trong 1 - 2 phút.

- Lấy miếng giấy lọc ra, nghiêng cho hết thuốc nhuộm chảy xuống chậu hứng, rửa bằng nước cất, nhỏ dung dịch Lugol lên vết bôi, giữ trong 5 phút.

- Rửa tiêu bản bằng nước, cồn ( trong 20 giây), rửa lại bằng nước cất.

- Nhỏ dung dịch Fucshin lên giữ trong 1 - 2 phút.

- Rửa tiêu bản bằng nước, hong khô tự nhiên. Đưa lên kính quan sát.

Mục đích của phương pháp nhuộm Gram là để phân biệt vi khuẩn Gram âm (G-) với vi khuẩn Gram dương (G+).Khả năng bắt màu của G+ và G- khác nhau do chất nguyên sinh của tế bào vi khuẩn G+ được cấu tạo từ một loại protein đặc biệt chứa muối nucleatmagie, có khả năng tạo với tím gentian và lugol một phức chất bền khó bị rửa trôi, nên khi quan sát trên tiêu bản thấy tế bào vi khuẩn G+bắt màu tím của gentiam. Trong khi đó những vi khuẩn G- không có khả năng tạo phức chất bền với thuốc nhuộm gentian và lugol nên dễ bị rửa trôi bởi cồn. Do đó, khi nhỏ fucshin lên tế bào vi khuẩn G- sẽ bắt màu hồng của Fucshin.

b). Kiểm tra đặc tính sinh học của Acetobacter [2][4]

* Kiểm tra khả năng oxi hoá ethanol thành axit axetic

Như trên đã nói, Acetobacter và Gluconomonas là 2 giống vi khuẩn có đặc tính hình thái, sinh lý tương tự nhau. Vì vậy cần phải sơ tuyển chọn ra nhũng chủng Acetobacter thuần khiết bằng phương pháp thử khả năng oxi hoá ethanol thành axit axetic trên môi trường A và B:

Môi trường A: dịch chiết nấm men: 3%; CaCO3: 2%; rượu etylic: 15% - 2ml; agar- agar: 2%. Khi nuôi cấy vi khuẩn axetic trên môi trường A nếu là Gluconobacter thì có một vòng sáng xung quanh khuẩn lạc, nếu là Acetobacter thi vòng sáng sẽ rõ hơn và có một lớp cặn đục ở viền khuẩn lạc hướng về phía vòng sáng - do vi khuẩn sinh trưởng và phát triến sẽ tạo ra axit axetic - axit này tạo ra sẽ kết hợp với CaCO3 làm vòng sáng rộng hơn và tạo lớp cặn đục thấy rõ.

Môi trường B: dịch chiết nấm men: 3%; agar - agar: 2%; rượu etylic:

15% - 2ml, 1ml xanh lục bromocresol 2,2%. Khi nuôi cấy vi khuẩn axetic trên môi trường B nếu là Glucononbacter làm môi trường biến đổi thành màu vàng, nếu là Acetobacter cũng làm môi trường biến đổi thành màu vàng nhưng có một vành màu xanh lơ do quá trình oxi hoá các axit.

* Phương pháp xác định khả năng tổng hợp axit axetic bằng chuẩn độ với NaOH 0,1N có phenolphtalein làm chỉ thị [2][4]

Cho vào bình  loại 100ml (hay 250 ml): 10ml dịch lên men thêm vào đó 1 đến 2 giọt phenolphtalein, chuẩn độ bằng NaOH 0,1N. Tính số gam axit trong 100 ml dịch lên men.

Lưu ý: Khi chuẩn độ cần lắc nhẹ đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt bền trong 30 giây là được.

Công thức tính: V.K.1000 X 10 (g/l)

Trong đó: X: số gam axit trong 1l dung dịch lên men

V: số ml NaOH 0,1N dùng chuẩn 10ml dung dịch lên men

K: lượng axit tương ứng với 1 ml NaOH 0,1N; K = 0,006 (đối với axit axetic) 10: số ml dịch đem chuẩn độ

* Phát hiện hoạt tính catalase [2] [7][9]

Nhỏ 1 giọt H2O2 3% lên sinh khối tế bào của chủng nghiên cứu được tách từ dịch, nuôi cấy bằng li tâm 3000 vòng trong 20 phút. Nếu thấy hiện tượng sủi bọt thì chủng đó được coi là có hoạt tính catalase (catalase +), nếu không thấy sủi bọt thì chủng vi khuẩn đó không có hoạt tính catalase (catalase-)

c). Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn [2] [4]

Lấy 1 ml dịch huyền phù có chứa tế bào vi khuẩn có thời gian nuôi cấy khác nhau tùy theo yêu cầu của nghiên cứu, pha loãng theo phương pháp pha

loãng Pasteur, dùng micropipet hút 100l dịch pha loãng, trang đều trên môi trường thạch đĩa. Nuôi ở 300C trong 3 ngày đếm số khuẩn lạc (CFU) trong môi trường đĩa petri, từ đó xác định số lượng tế bào vi khuẩn trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức.

1000 1

. .

100 10 n

N  A 

Trong đó: N - Tổng số CFU trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu.

A- Số CFU trung bình đếm được trên mỗi đĩa petri.

10-n - Độ pha loãng dịch nuôi cấy.

2.2.1.4. Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng mỏng [7] [8]

Mục đích nghiên cứu này là tuyển chọn được chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng mỏng, dai, chắc chế tạo màng sinh học dùng cho trị bỏng. Do vậy chủng vi khuẩn được tuyển chọn thông qua các chỉ tiêu sau:

- Quan sát quá trình hình thành màng đặc điểm tạo thành màng trên môi trường lỏng ( dày, mỏng, nhăn, trơn, có ăn theo thành bình hay không).

- Quan sát đặc điểm của môi trường nuôi cấy các mẫu A.xylinum (đục hay trong).

- Xác định hàm lượng axit axetic tạo thành của mỗi mẫu.

- Quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi quang học.

- Đối chiếu so sánh đặc điểm giống nhau của các chủng đã phân lập được với các chủng đã biết dựa vào hệ số giống nhau để tuyển chọn các chủng cho màng mỏng.

- Nghiên cứu đặc tính sinh lý của chủng đã được chọn.

- Kiểm tra tính chịu lực của màng.

2.2.1.5.Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum bằng phương pháp đo mật độ quang (Optical Density – OD) [2]

Bước 1: xác định tương quan giữa số lượng tế bào (CFU) vi khuẩn Acetobacter xylinum với giá trị OD610

- Lấy 1ml dịch nuôi cấy vi khuẩn Acetobacter xylinum cho vào ống effendorf, đem ly tâm với tốc độ 10000 vòng/ phút, bỏ phần dịch giữ lại phần sinh khối.

- Cho 1ml nước cất vào phần sinh khối, vontex đều, tiếp tục quay ly tâm ( lặp lại 3 lần).

- Phần cặn còn lại hoà với 1ml nước cất, vontex đều, pha loãng ở các độ pha loãng khác nhau. Ở mỗi độ pha loãng hút 100l dịch trang đều trên môi trường thạch đĩa. Nuôi trong tủ ấm, sau 4 ngày đếm số lượng khuẩn lạc trong mỗi hộp petri. Phần dịch pha loãng ở mỗi nồng độ đem đo OD ở bước sóng 610nm (đối chứng là nước cất - mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần).

- Xây dụng đồ thị tương quan giữa số lượng tế bào với giá trị OD ở  = 610 nm tương ứng ở các độ pha loãng khác nhau. Ta sẽ có được một hàm số tương quan giữa 2 đại lượng này.

Bước 2: xác định giá trị OD ở bước sóng 610 nm của dịch nghiên cứu, dựa vào đồ thị chuẩn để tính ra số lượng tế bào có trong dịch nghiên cứu đó vào các thời điểm nuôi cấy khác nhau.

2.2.2. Phương pháp toán học [9][14]

Mục đích của phương pháp qui hoạch hóa toán học thực nghiệm này là xác định thành phần môi trường dinh dưỡng thích hợp, điều kiện nuôi cấy phù hợp cho quá trình lên men axetic vi khuẩn Acetobacter xylinum để tạo màng sinh học. Sử dụng phương pháp qui hoạch hóa toán học thực nghiệm cho

phép chúng ta nghiên cứu đồng thời tác động của nhiều yếu tố đến quá trình lên men cũng như sự tác động qua lại của các yếu tố đó.

Thực tế có nhiều phương pháp để tối ưu nhưng người ta hay sử dụng phương pháp Box - Wilson (phương pháp độ dốc). Đó là phương pháp cho phép dẫn dắt các yếu tố đến vùng tối ưu khi các biến này đồng thời thay đổi cùng một lúc.

Phương pháp Box - Wilson gồm hai bước chính:

2.2.2.1. Thiết lập mô hình toán học

Mục đích việc thiết lập mô hình toán học cho phép ta thấy được mối liên hệ giữa hàm mục tiêu với các biến dưới dạng mặt đồng mức. Mặt đồng mức được biểu diễn bằng phương trình hồi qui có dạng:

3 3 2 2 1 1

0 X~

b X~ b X~ b b

y   

Trong đó: y: Hàm mục tiêu X~1

: Biến số mã (Kod) bi : Các hệ số

Phương pháp Box - Wilson chỉ có hiệu quả khi mô hình tuyến tính, các hệ số của phương trình đều có nghĩa. Nếu hệ số nào không có nghĩa thì cần loại khỏi mô hình.

- Để thiết lập mô hình toán học phải tiến hành các bước sau:

Xác định các chỉ tiêu tối ưu

Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến chỉ tiêu tối ưu Xác định mức của các biến

Mức 0: là tương ứng với các giá trị 0i a b

x 2

 

a: giới hạn dưới của khoảng xác định b: giới hạn trên của khoảng xác định

Mức dưới: tương ứng là xi1x0i Mức trên: tương ứng với xi1x0i

Xác định khoảng biến thiên của các yếu tố, đó là khoảng bé nhất khi biến số thay đổi một lượng như vậy, thì sẽ dẫn đến sự thay đổi trông thấy của hàm mục tiêu.

Ma trận thực nghiệm: số thí nghiệm phải làm (N) để thiết lập mô hình với n yếu tố là: N = 2n với  là số mức.

Kiểm tra sự hội tụ của các số liệu

Mục đích để xem các số liệu có cùng một độ chính xác không, đầu tiên cần tính phương sai:

S2j  k 11 j 1k yiyij2 (3)

Trong đó: k: Số lần đo lặp lại của thí nghiệm yj: Số đo trung bình của thí nghiệm Yij: Số đo lần thứ i của thí nghiệm Tiếp tục tính:







2 j TT N

2 j 1 j

max S G

S

(GTT = Gtính toán) (4)

Điều kiện để các sai số hội tụ là: GTT < GB (GB: là GBảng) GB tính được bằng cách tra bảng chuẩn Corhran khi biết bậc tự do f1 = k - 1 và f2 = N.

Tính các hệ số của phương trình hồi qủ. Các hệ số hồi qui được xác định:







N

1 j

0 y

N

b 1 (5)

i

N

1 j

i

i X~

N y

b 1 



 Với i = 1; 2; 3. (6)

Tất cả các hệ số trên giúp ta xác định được mức độ ảnh hưởng của các biến lên hàm mục tiêu. Dấu của các hệ số cho biết hiệu ứng tác động của các biến tương ứng lên hàm mục tiêu theo chiều hướng nào.

Đối với những hệ số quá bé có thể coi là không có nghĩa nên hầu như không ảnh hưởng gì tới hàm mục tiêu và được loại khỏi mô hình.

Kiểm tra sự có nghĩa của các hệ số.

Các hệ số thu được đánh giá dựa vào tiêu chuẩn Student, các hệ số không có nghĩa thì bị loại khỏi mô hình. Hệ số có nghĩa thì yêu cầu phải thỏa mãn bi S .tb .

Với t: giá trị chuẩn Student được xác định bằng cách tra bảng khi biết trước N và bậc tự do f = N (k-1)

Sb được xác định bằng:

Tính phân phối trung bình của từng thí nghiệm







N

1 j

2 j 2

y S

N

S 1 (7)

Tính phân phối trung bình cho mỗi lần đo:







N

1 j

2 j 2

y S

k . N

S 1 (8)

Tính phân phối mà các hệ số xác định:

B

S S

2 y

b  (9)

B: là hệ số của phương trình hồi qui

- Thông thường giữa số liệu thực nghiệm và mô hình bao giờ cũng có những sai lệch nhất định, để đánh giá độ sai lệch giữa thực nghiệm và mô hình ta dùng tiêu chuẩn Fisher.

- Mô hình chỉ thích ứng khi FTT < FB, trong đó FB tìm được bằng cách tra bảng Fisher khi biết: F1 = n-1; F2 = N (k-1)