Mẫu đất đ−ợc lấy ngẫu nhiên tại các vị trí khác nhau. Lấy mẫu đất tại các lớp đất mặt (0,1 - 0,2cm) và đất sâu (10 cm).
Dùng dụng cụ vô trùng lấy mẫu đất ở các lớp đất mặt (0,1 – 0,2cm) và
đất sâu (10 cm) tại các vị trí ngẫu nhiên. Đựng các mẫu đất vào các túi nilon vô trùng, buộc kín miệng túi, đánh số, ghi độ sâu lấy mẫu... sau đó các mẫu
đất đ−ợc bảo quản, vận chuyển về phòng thí nghiệm để tiến hành phân lập.
3.2.2. Ph−ơng pháp phân lập và đếm số l−ợng tế bào
Dùng dụng cụ vô trùng lấy 1gam đất cho vào bình nước muối sinh lý vô
trùng 99 ml, lắc đều, pha loãng ở 102 lần. Tiếp tục hút 1ml dịch huyền phù cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lí vô trùng, lắc đều, pha loãng ở 103 lÇn.
Dùng pipet vô trùng hút 0,2 ml dịch huyền phù ở độ pha loãng 103 lần nhỏ lên bề mặt môi trường Gause I, Czapek – tinh bột tan, đã chuẩn bị trong các hộp petri. Trang đều dịch đất lên mặt môi trường, nuôi trong tủ ấm 280C- 300C. Sau 7 - 14 ngày mang các hộp petri ra quan sát, đếm số l−ợng khuẩn lạc xạ khuẩn.
Từ đó tính số l−ợng xạ khuẩn trong 1gam đất theo công thức:
(CFU)
V b X X
M =( +2δ )× / Trong đó :
M : Tổng số xạ khuẩn trong 1gam đất.
:
X Số khuẩn lạc mọc lên từ độ pha loãng này :
2δX Độ lệch bình ph−ơng trung bình.
b: Độ pha loãng nuôi cấy.
V: Thể tích dịch huyền phù dùng để phân lập.
CFU: Đơn vị hình thành khuẩn lạc (Colony Forming Unit).
Đại học s− phạm Hμ Nội 2 K31B – Sinh20
3.2.3.Ph−ơng pháp bảo quản và sử dụng giống
Dùng que cấy vô trùng tách xạ khuẩn từ các khuẩn lạc riêng rẽ sang các ống môi trường thạch nghiêng Gause I đã chuẩn bị sẵn. Sau 7 - 14 ngày nuôi cấy, lấy ra kiểm tra và loại bỏ những ống nhiễm sau khi đã tách loại xạ khuẩn sang các ống khác, cuối cùng thu đ−ợc các ống giống thuần.
Các ống giống thuần đ−ợc bảo quản ở tủ lạnh 2 – 40C. Cấy truyền định kì 1 tháng một lần. Trước khi tiến hành nghiên cứu các đặc điểm sinh lý - hoá
sinh cần phải hoạt hoá các chủng xạ khuẩn và cấy truyền giữ giống.
3.2.4. Ph−ơng pháp quan sát hình thái xạ khuẩn 3.2.4.1. Ph−ơng pháp xẻ r∙nh thạch
Cấy xạ khuẩn lên môi tr−ờng dinh d−ỡng trong hộp petri bằng cách trải dày bằng que trang. Dùng dao vô trùng xẻ một rãnh thạch trong hộp petri. Đặt một hoặc hai lá kính vô trùng lên bờ của rãnh thạch vừa xẻ, đậy nắp hộp petri
để vào tủ ấm 280 – 300C trong 7 – 14 ngày. Lấy ra quan sát và chụp ảnh cuống sinh bào tử, hệ sợi dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 -1000 lần.
3.2.4.2. Ph−ơng pháp khối thạch
Đổ môi tr−ờng Gause I vô trùng vào hộp petri sao cho thành một lớp mỏng (1 - 1,5mm). Đổ khô môi tr−ờng, dùng khoan nút chai (θ = 0,9mm) khoan các khối thạch. Đặt các khối thạch lên lam kính vô trùng đã chuẩn bị sẵn, đặt trong hộp petri vô trùng (trong mỗi hộp petri có một cục bông ẩm).
Cấy xạ khuẩn lên khối thạch. Đặt vào tủ ấm 280 - 300C trong 7 - 14 ngày. Quan sát hệ sợi và cuống sinh bào tử dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 – 1000 lần.
3.2.5. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc
Nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường Gause I thạch đĩa hoặc thạch nghiêng. Quan sát hình thái và mô tả màu sắc khuẩn lạc xạ khuẩn theo thang màu chuẩn của Bondarsev (1954), qua đó sơ bộ phân nhóm xạ khuẩn.
3.2.6. Ph−ơng pháp nghiên cứu các đặc điểm sinh lí, sinh hoá
Đại học s− phạm Hμ Nội 2 K31B – Sinh21
3.2.6.1. Xác định axit amin đặc tr−ng cho thành tế bào
Nuôi cấy xạ khuẩn trong môi tr−ờng dịch thể Gause I và Gause II, trong 7 ngày ở nhiệt độ 280 -300C trên máy lắc với tốc độ 200 - 220 vòng/phút. Li tâm thu sinh khối và sấy khô trong 2 giờ ở nhiệt độ 400C. Rửa sạch sinh khối bằng nước cất và cồn rồi làm khô ở nhiệt độ 280 C.
Cân 10 mg sinh khối sấy khô, bổ sung 1ml dung dịch HCl 1N nút kín và thuỷ phân ở nhiệt độ 600C trong vòng 4 giờ.
Dịch được đun cách thuỷ để loại HCl và bổ sung thêm nước cất đến khi PH đạt tới 5,6 – 6,0.
Chấm 20 μm dịch lên giấy sắc kí chạy trong hệ dung môi mêtanol: H20:
HCl 6N: Pirimidin = 40:13:2:5 trong 17giờ. Để giấy khô tự nhiên và hiện hình bằng dung dịch ninhydrin 0,5% trong aceton, sấy khô ở 800C.
Dạng LL - DAP có vệt màu vàng chanh còn dạng m - DAP có vệt màu xanh lá cây và chạy chậm hơn LL - DAP.
3.2.6.2. Xác định hoạt tính enzim amylase, protease và cellulase
Cấy chấm điểm xạ khuẩn trên môi trường thạch đĩa có các cơ chất tương ứng. Sau 7 ngày thử hoạt tính enzim bằng thuốc thử đặc tr−ng và đo vòng phân giải (D-d,mm) với D: vòng phân giải cơ chất, d: đ−ờng kính xạ khuẩn.
Xác đinh hoạt tính enzim protease bằng môi tr−ờng thạch chứa 1% tinh bột tan hoặc tinh bột sắn. Thuốc thử lugol.
Xác định hoạt tính enzim protease bằng môi trường chứa 5% bột sữa tách bơ.
* Môi tr−ờng thử hoạt tính protease:
Lấy 500ml H20 bổ sung 18g thạch, hấp ở 1210C trong 30phút (1).
Lấy 500ml H20 hoà tan với 5g bột sữa, hấp ở 800C lần 1 để nguội rồi hấp 800C lần 2, để nguội đến 400C (2).
Sau khi hấp xong (1) và (2), đổ (1) vào (2) để loại phần vẩn đục ra, lắc tan và đổ môi trường bình thường.
Đại học s− phạm Hμ Nội 2 K31B – Sinh22
Xác định hoạt tính enzim cellulose bằng môi trường chứa 0,5% bột giấy và CMC, thử bằng thuốc thử lugol.
3.2.6.3. Xác định khả năng nitrit và nitrat hoá
Nuôi cấy xạ khuẩn trong ống nghiệm chứa môi tr−ờng lỏng Gause I với KNO3 thay bằng (NH4)2SO4 (thử hoạt tính nitrit hoá) và KNO2 (thử hoạt tính nitrat hoá).
Cho 1 – 2 giọt dịch nuôi cấy vào bản sứ lõm, thêm vào đó 1 giọt thuốc thử Griss I và 1 giọt Griss II. Khi có mặt muối nitrit dịch có màu đỏ còn khi môi tr−ờng chỉ có mặt nitrat thì dịch có màu trắng.