PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Nguyên liệu
Các mẫu đất lấy từ các loại đất thuộc phường Xuân Hòa – Phúc Yên – Vĩnh Phúc.
2.1.2. Hóa chất
Các hóa chất: K2HPO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O, NH4Cl, KNO3, KNO2, NaNO3, (NH4)2SO4, NaCl, FeSO4…..
Tinh bột tan, saccharose, thạch agar, CMC (Cacboxyl Methyl Cenlulose), bột giấy…
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
- Dụng cụ: hộp petri, ống nghiệm, bàn trang, que cấy, đèn cồn, bình tam giác, giá đựng ống nghiệm.
- Thiết bị: tủ ấm vi sinh (Heraeus – Đức), tủ sấy (Heraeus – Đức), nồi hấp (Tomy – Nhật Bản), cân Sartorius, tủ cấy vô trùng, tủ lạnh.
2.1.4. Môi trường phân lập xạ khuẩn - Môi trường 1: Gause I, pH = 7,0
Hóa chất Khối lƣợng
Tinh bột tan 20g
KH2PO4 0,5 g
KNO3 1 g
MgSO4.7H2O 5 g
NaCl 0,5 g
H2O 1000ml
FeSO4 Vết
Thạch agar 20g
Khóa luận tốt nghiệp Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2
Trần Thị Ly K32D – Sinh 18 - Môi trường 2: Czapeck - tinh bột, pH = 7,2- 7,4
Hóa chất Khối lƣợng
Tinh bột tan 20g
KH2PO4 1g
NaNO3 3g
MgSO4.7H2O 0,5g
KCl 0,1g
NaCl 0,1g
H2O 1000ml
FeSO4 Vết
Thạch agar 20g
- Môi trường 3: Czapeck (nguyên gốc), pH = 7,2
Hóa chất Khối lƣợng
Sacharose 20g
K2HPO4 1g
NaCl 30g
MgSO4.7H2O 0,5g
H2O 1000ml
FeSO4 Vết
Thạch agar 20g
Khóa luận tốt nghiệp Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2
Trần Thị Ly K32D – Sinh 19 2.1.5. Môi trường thử hoạt tính phân giải cellulose của xạ khuẩn
- Môi trường 1: 1% CMC
Hóa chất Khối lƣợng
NaNO3 1,5g
KH2PO4 0,5g
MgSO4.7H2O 0,5g
KCl 0,5g
NaCl 10g
Thạch Agar 20g
CMC 10g
H2O 1000ml
- Môi trường 2: 1% bột giấy
Hóa chất Khối lƣợng
NaNO3 1,5g
KH2PO4 0,5g
MgSO4.7H2O 0,5g
KCl 0,5g
NaCl 10g
Thạch Agar 20g
Bột giấy 10g
H2O 1000ml
+ Chuẩn bị nước chiết đất :
Lấy 1kg đất hòa với 1l nước sạch sau đó đun sôi khoảng 30 phút, bổ sung thêm 1g CaCO3. Lọc lấy nước trong.
Khóa luận tốt nghiệp Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2
Trần Thị Ly K32D – Sinh 20 2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp lấy mẫu [3]
Trên mỗi loại đất dùng dụng cụ lấy đất ở các độ sâu 0cm, 5cm, 10cm, 15cm, 20cm, 25cm, 30cm. Ở mỗi độ sâu thì lấy khoảng 10g cho vào túi nilon, trên túi có ghi độ sâu lấy mẫu, nơi lấy mẫu, loại đất, sau đó buộc túi lại để tránh bay hơi nước và tránh các VSV lạ xâm nhập vào. Mẫu đất sau khi được thu thập cần phải tiến hành phân lập ngay. Nếu chưa phân lập được thì phải bảo quản mẫu trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4-50C.
2.2.2. Phương pháp phân lập xạ khuẩn từ mẫu đất [3]
Lấy 1g đất cho vào ống nghiệm chứa sẵn 10ml nước cất vô trùng lắc đều rồi dùng pipet hút 1ml dung dịch đất này cho sang ống nghiệm có chứa sẵn 9ml nước cất vô trùng lắc đều thu được dịch đất với độ pha loãng 10-1 cứ tiếp tục như vậy với ống nghiệm tiếp theo ta có dung dịch đất với độ pha loãng 10-2, 10-3,.... 10-10. Tùy theo mật độ phân bố của xạ khuẩn trong mẫu đất mà ta chọn dịch đất có độ pha loãng thích hợp. Ở đây tôi chọn dịch đất có độ pha loãng 10-5, 10-7. Dùng pipet vô trùng hút 0,5 ml dung d ịch đất có độ pha loãng 10-5, 10-7 nhỏ lên bề mặt thạch trong hộp petri, lấy bàn trang thủy tinh trang đều khắp bề mặt thạch. Với mỗi mẫu đất ở các độ sâu trên cấy lên 3 môi trường: Gause I, Czapeck-tinh bột khoáng, Czapeck. Sau đó nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 30oC, theo dõi các khuẩn lạc xạ khuẩn mọc trên bề mặt thạch.
Cấy truyền những khuẩn lạc xạ khuẩn mọc riêng biệt không bị nhiễm sang các ống thạch nghiêng có chứa môi trường Gause I. Các giống này được đưa vào tủ ấm và giữ ở nhiệt độ 30oC sau 3 - 4 ngày mang ra kiểm tra lại nếu thấy ống nghiệm nào không mọc hoặc bị nhiễm thì loại bỏ cấy truyền lại để cuối cùng ta được các ống nghiệm có các chủng xạ khuẩn thuần chủng.
Khóa luận tốt nghiệp Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2
Trần Thị Ly K32D – Sinh 21 2.2.3. Phương pháp bảo quản chủng giống [2]
Tiến hành cấy truyền định kì một tháng một lần trên môi trường Gause I, để mẫu cấy nuôi trong tủ ấm 28 - 300C từ 7 - 10 ngày, sau dó giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 2- 40C. Trước khi sử dụng phải cấy truyền sang ống thạch mới.
2.2.4. Phương pháp quan sát hình thái xạ khuẩn
Phương pháp xẻ rãnh khối thạch: Xạ khuẩn được rải đều trên bề mặt hộp petri chứa môi trường Gause I. Dùng dao vô trùng xẻ hai đường song song ở giữa hộp lồng, bỏ khối thạch ở giữa hai đường xẻ ra ngoài. Sau đó đặt lamen vô trùng chéo theo rãnh thạch vừa xẻ. Để hộp lồng nuôi cấy trong tủ ẩm 3- 5 ngày, lấy lamen ra quan sát phần xạ khuẩn mọc lan giữa hai đường xẻ trên kính hiển vi quang học[1].
2.2.5. Phương pháp xác đinh khả năng sinh cellulase của xạ khuẩn Phương pháp nhỏ dịch
Nuôi lắc xạ khuẩn trong môi trường Gause I, lắc 160 vòng/phút trong 3 ngày. Sau đó li tâm 4000 vòng/phút loại sinh khối.
Nhỏ 0,1 ml dich enzyme vào lỗ thạch trong hộp petri có môi trường chứa cơ chất và thạch. Để hộp lồng vào trong tủ lạnh 4h, sau đó nuôi trong tủ ấm 2 ngày. Thử hoạt tính bằng thuốc thử rồi đo vòng phân giải.
Xác định hoạt tính cellulase bằng môi trường chứa 1% CMC và bột giấy, thử bằng thuốc thử Lugol I.
Phương pháp cấy chấm điểm
Chuẩn bị môi trường thạch đĩa chứa 1% CMC hoặc bột giấy. Dùng que cấy chấm nhẹ vào khuẩn lạc sau đó chấm nhẹ một điểm xuống bề thạch đĩa.
Nuôi khuẩn lạc trong tủ ấm sau 4 ngày mang ra thử hoạt tính với thuốc thử Lugol I, đo kích thước vòng phân giải.
Khóa luận tốt nghiệp Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2
Trần Thị Ly K32D – Sinh 22
CHƯƠNG 3