PHẦN III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
IV. KẾT QUẢ ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC CỦA HÀ LAN
4.1. Kết quả nghiên cứu xây dựng Quy trình nhân giống hoa Lilium bằng in vitro
4.1.1. Kết quả nghiên cứu xây dựng Quy trình nhân giống hoa lily Manissa bằng nuôi cấy in vitro
* Ảnh hưởng của thời gian khử trùng mẫu bằng H2O2 30% đến mẫu cấy Bảng 61: Kết quả khử trùng mẫu (sau 4 tuần)
Thời gian khử trùng (phút)
Tỷ lệ mẫu sạch sống (%)
Tỷ lệ mẫu không phản ứng (%)
Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)
CT1: 10 21 26 53
CT2: 10 và 5 32 29 39
CT3: 15 40 34 26
CT4: 15 và 5 77 20 3
CT5: 20 66 31 3
CT6: 20 và 5 39 38 23
Ghi chú: môi trường nền là: MS + 30g/l sacarose
Qua bảng 61 cho thấy:
+ CT1: khi khử trùng ở chế độ 10 phút tỷ lệ mẫu sạch sống thấp chỉ đạt 21%, mẫu nhiễm rất cao 53%.
+ CT2, CT3 khi tăng thời gian khử trùng lên thì kết quả tỷ lệ mẫu sống sạch tăng và tỷ lệ mẫu nhiễm giảm. Tỷ lệ
mẫu sống sạch cũng tăng lên và đạt tỷ lệ mẫu sống sạch cao nhất 77% ở CT4 (ở thời gian 15 phút lần 1 và 5 phút lần 2).
+ CT5, CT6: khi tiếp tục tăng thời gian khử trùng lên 20 phút thì tỷ lệ mẫu sống sạch lại giảm còn 66% và chỉ còn 39% khi khử trùng 20 phút lần 1 và 5 phút lần 2.
* Ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng và hàm lượng đường tới khả năng tạo củ từ vảy củ hoa lily
Hình 24: Mẫu phát sinh hình thái
a, Ảnh hưởng của một số chất thuộc nhóm auxin là IAA, IBA, 2,4D, αNAA đến sự phát sinh củ từ vảy củ
Bảng 62: Ảnh hưởng của các chất auxin đến khả năng tạo củ in vitro từ vảy củ (sau 8 tuần)
CTTN
Số mẫu TN
Tỷ lệ tạo củ
(%)
Hệ số tạo củ (lần)
Khối lượng củ
TB (g) CT1: MS + 30g/l sacarose + 0,5
mg/l IAA 90 72,6 3,03 0,13
CT2: MS + 30g/l sacarose + 0,5
mg/l IBA 90 71,3 3,23 0,12
CT3: MS + 30g/l sacarose +
0,5 mg/l αNAA 90 73,3 3,60 0,15
CT4: MS + 30g/l sacarose + 1,0
mg/l IAA 90 82,3 3,20 0,12
CT5: MS + 30g/l sacarose + 1,0
mg/l IBA 90 76,6 2,86 0,17
CT6: MS + 30g/l sacarose + 1,0
mg/l αNAA 90 90,3 2,56 0,16
CV% 3,8
LSD0,05 0,21
Ghi chú: Môi trường nền: MS + 30g/l sacarose
Kết quả bảng 62 cho thấy: Tất cả những auxin sử dụng trong thí nghiệm đều có tác dụng trong việc tạo củ lily in vitro, tỷ lệ tạo củ đều đạt trên 70% ở cả 6 công thức.
Trong các chất sử dụng thì hoạt tính của αNAA tỏ ra tốt hơn so với IAA, IBA, các công thức bổ sung αNAA có hệ số tạo củ cao hơn so với 2 công thức bổ sung IAA, IBA.
Nhưng khi nồng độ các chất tăng lên thì hệ số tạo củ và khối lượng củ lại giảm.
+ IAA: khi nồng độ IAA 0,5mg/l (CT1) thì hệ số tạo củ 3,23. Nếu tăng nồng độ lên 1,0mg/l (CT4) thì hệ số tạo củ 3,20.
+ IBA: khi nồng độ IBA 0,5mg/l (CT2) thì hệ số tạo củ 3,03. Nếu tăng nồng độ lên 1,0mg/l (CT5) thì hệ số tạo củ 2,86.
+ Khi nồng độ αNAA là: 0,5mg/l (CT3) thì hệ số tạo củ 3,60. Nếu tăng nồng độ lên 1,0mg/l (CT6) thì hệ số tạo củ 2,56.
b, Ảnh hưởng của hàm lượng đường và nồng độ của (IAA, IBA, αNAA) đến khả tạo củ in vitro từ vảy củ
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá ảnh hưởng của đường sacarose ở các hàm lượng khác nhau đến khả năng tạo củ từ lát cắt vảy. Kết quả thể hiện ở bảng 63.
Bảng 63: Ảnh hưởng của hàm lượng đường và nồng độ của (IAA, IBA, αNAA) đến khả năng tạo củ lily in vitro trực tiếp từ vảy củ (sau 8 tuần)
CTTN
Số mẫu TN
Tỷ lệ tạo củ
(%)
Hệ số tạo củ (lần)
Khối lượng củ
TB (g) CT1: MS + 60g/l sacarose + 0,5 mg/l IAA 90 86,5 2,96 0,13 CT2: MS + 60g/l sacarose + 0,5 mg/l IBA 90 91,3 2,96 0,14 CT3: MS + 60g/l sacarose + 0,5 mg/l αNAA 90 100 3,16 0,13 CT4: MS + 90g/l sacarose + 0,5 mg/l IAA 90 92,4 3,26 0,15 CT5: MS + 90g/l sacarose + 0,5 mg/l IBA 90 93,6 3,36 0,14 CT6: MS + 90g/l sacarose + 0,5 mg/l αNAA 90 100 3,43 0,15 CT7: MS + 120g/l sacarose + 0,5 mg/l IAA 90 95,4 3,23 0,15 CT8: MS + 120g/l sacarose + 0,5 mg/l IBA 90 97,4 3,06 0,14 CT9: MS + 120g/lsacarose + 0,5mg/l αNAA 90 100 2,93 0,17
CV% 3,50
LSD0,05 0,18
Qua kết quả bảng 63 cho thấy: hàm lượng đường và nồng độ của các auxin khác nhau đã ảnh hưởng khác nhau đến sự tạo củ lily in vitro. Tỷ lệ tạo củ ở các công thức đều đạt rất cao nhưng chỉ ở các công thức bổ sung αNAA mới đạt 100%, chứng tỏ αNAA phản ứng rất tốt với mẫu cấy. Mặt khác, hàm lượng đường cũng đã có ảnh hưởng đến sự tạo củ in vitro, ở các công thức có bổ sung hàm lượng đường 90g/l có hệ số tạo củ cao hơn so với các công thức có hàm lượng đường là 60g/l và 120g/l. CT6 có hệ số tạo củ cao nhất đạt 3,43 lần.
* Nghiên cứu khả năng tạo củ từ củ hoa lily in vitro
a, Ảnh hưởng của tổ hợp cytokinin + auxin đến khả tạo củ từ củ hoa lily in vitro Vảy củ sau khi được cắt với kích thước 4-5mm được sử dụng làm vật liệu nuôi cấy cho thí nghiệm, nồng độ αNAA được sử dụng 0,5mg/l và nồng độ BAP (0,1- 0,9)mg/l. Trong tạo củ in vitro, có nhiều sự cân bằng quan trọng, nhất là cân bằng giữa auxin/cytokinin và cân bằng GA/ABA. Trong thí nghiệm này, cân bằng auxin/cytokinin được khảo sát trên sự tạo củ lily in vitro thông qua cân bằng của αNAA và BAP. Kết quả thể hiện ở bảng 64.
Bảng 64: Ảnh hưởng của tổ hợp αNAA và BAP đến khả năng tạo củ lily từ củ in vitro hoa lily (sau 8 tuần)
CTTN
Số mẫu
TN
Tỷ lệ tạo củ
(%)
Hệ số tạo củ (lần)
Khối lượng củ
TB (g) CT1: MT5+ 0,5 mg/lαNAA + 0,1 mg/l BAP 90 100 3,26 0,20 CT2: MT5 + 0,5 mg/lαNAA + 0,2 mg/l BAP 90 100 3,36 0,23 CT3: MT5 + 0,5 mg/lαNAA + 0,3 mg/l BAP 90 100 3,43 0,23 CT4: MT5 + 0,5 mg/lαNAA + 0,4 mg/l BAP 90 100 3,73 0,28 CT5: MT5 + 0,5 mg/lαNAA + 0,5 mg/l BAP 90 100 4,50 0,33 CT6: MT5 + 0,5 mg/lαNAA + 0,6 mg/l BAP 90 100 4,33 0,34 CT7: MT5 + 0,5mg/lαNAA + 0,7 mg/l BAP 90 100 4,26 0,34 CT8: MT5 + 0,5 mg/lαNAA + 0,8 mg/l BAP 90 100 4,13 0,35 CT9: MT5 + 0,5 mg/lαNAA + 0,9 mg/l BAP 90 100 4,03 0,35
CV% 0,14
LSD0,05 2,10
Ghi chú: MT5: MS + 90g/l sacarose
Qua kết quả cho thấy: khi bổ sung tổ hợp BAP và αNAA thì tỷ lệ tạo củ ở tất cả các công thức đều đạt 100%, khối lượng củ tăng dần từ CT1 đến CT9, hệ số tạo củ tăng dần từ CT1 (3,26 lần) đến CT5 (4,5 lần) khi nồng độ BAP tăng từ (0,1 mg/l – 0,5mg/l), nhưng nếu tiếp tục tăng nồng độ BAP lên thì hệ số tạo củ lại có xu hướng giảm dần. Vì vậy công thức thích hợp cho sự nhân củ là CT5 với hệ số tạo củ đạt cao nhất (4,5 lần) và khối lượng củ TB đạt 0,33g.
b, Ảnh hưởng của kiểu nuôi cấy đến khả tạo củ từ củ in vitro hoa lily
Trong thời gian gần đây cũng có nhiều nghiên cứu đã thử nghiệm các kiểu nuôi cấy trên các môi trường như đặc, đặc - lỏng, bán lỏng, lỏng, lỏng lắc để kích thích quá trình nhân nhanh của của lily in vitro đạt hiệu quả. Vì vậy, trong khuân khổ nghiên cứu này, chúng tôi cũng nghiên cứu các kiểu môi trường nuôi cấy đến sự hình thành củ in vitro của giống hoa lily Manissa. Kết quả thể hiện ở bảng 65.
Bảng 65: Ảnh hưởng của kiểu nuôi cấy đến khả năng tạo củ từ củ in vitro hoa lily (sau 8 tuần)
CTTN Số mẫu
TN Tỷ lệ tạo củ
(%)
Hệ số tạo củ (lần)
Khối lượng củ TB (g)
CT1: MT đặc 90 100 4,67 0,20
CT2: MT đặc - lỏng 90 100 3,40 0,22
CT3: MT bán lỏng 90 100 2,50 0,26
CT4: MT lỏng tĩnh 90 100 2,70 0,23
CT5: MT lỏng lắc 90 100 2,80 0,30
CV% 4,70
LSD0,05 0,20
Qua bảng 65 cho thấy: khi nuôi cấy trên môi trường đặc thì quan sát được sự hình thành củ diễn ra chậm hơn, đồng thời củ có khối lượng nhỏ hơn so với khi nuôi
cấy trên các môi trường khác. Tuy nhiên hệ số tạo củ trên môi trường đặc lại đạt cao nhất 4,67 củ/1 lần
So với môi trường đặc thì các kiểu môi trường bán lỏng, lỏng cho thấy sự hình thành củ diễn ra nhanh hơn, kích thước củ to hơn so với kích thước củ khi nuôi trên môi trường đặc nhưng hệ số nhân củ thấp hơn chỉ đạt 2,5-2,8 củ/1 lần.
* Nghiên cứu khả năng tăng khối lượng củ
Những củ nhỏ in vitro thu được từ những thí nghiệm trên, tiếp tục được chuyển sang môi trường nuôi củ để củ đạt được khối lượng và kích thước cần thiết trước khi chuyển ra ươm.
Thí nghiệm sử dụng các hàm lượng đường khác nhau 30g/l, 60g/l, 90g/l, 120g/l và 150g/l và được đặt trong 2 chế độ chiếu sáng: 16h sáng/ngày và chế độ tối hoàn toàn. Kết quả thể hiện ở các bảng sau.
Bảng 66: Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến sự tăng khối lượng củ ở điều kiện 16h sáng/ngày (sau 8 tuần)
CTTN Khối lượng TB
củ trước khi nuôi cấy (g)
Khối lượng TB củ sau khi nuôi
cấy (g)
Tỷ lệ tăng khối lượng
củ (lần)
CT1: MS + 30g/l sacarose 0,21 0,31 1,47
CT2: MS + 60g/l sacarose 0,21 0,33 1,57
CT3: MS + 90g/l sacarose 0,21 0,34 1,61
CT4: MS + 120g/l sacarose 0,21 0,41 1,95
CT5: MS + 150g/l sacarose 0,21 0,34 1,61
CV% 5,7
LSD0,05 0,37
Kết quả bảng 66 cho thấy: khi hàm lượng đường tăng từ 30g/l đến 120g/l thì khối lượng củ tăng tỷ lệ thuận với hàm lượng đường, khối lượng củ tăng từ 0,31 gam đến 0,41 gam và tỷ lệ tăng 1,47 lần đến 1,95 lần. Nhưng khi hàm lượng đường tăng lên 150g/l thì khối lượng củ lại giảm còn 0,34 gam. Vậy với hàm lượng đường 120g/l (CT4) là thích hợp nhất cho sự nuôi lớn của củ trong điều kiện 16h sáng/ngày.
Bảng 67: Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến sự tăng khối lượng củ ở điều kiện tối hoàn toàn (sau 8 tuần)
CTTN Khối lượng TB củ trước khi
nuôi cấy (g)
Khối lượng TB củ sau khi nuôi cấy 8 tuần (g)
Tỷ lệ tăng khối lượng
củ (lần)
CT1: MS + 30g/l sacarose 0,21 0,34 1,61
CT2: MS + 60g/l sacarose 0,21 0,34 1,61
CT3: MS + 90g/l sacarose 0,21 0,39 1,85
CT4: MS + 120g/l sacarose 0,21 0,49 2,33
CT5: MS + 150g/l sacarose 0,21 0,42 2,00
CV% 4,1
LSD0,05 0,30
Kết quả thu được ở bảng 67 cho thấy: khối lượng củ tăng theo tỷ lệ thuận với sự tăng của hàm lượng đường, khi hàm lượng đường tăng từ 30g/l đến 120g/l thì khối lượng củ tăng từ 0,34 gam đến 0,49 gam và tỷ lệ tăng khối lượng 1,61 lần đến 2,33 lần. Nhưng nếu tiếp tục tăng hàm lượng đường lên 150g/l thì khối lượng củ giảm 0,42 gam. Trong hai điều kiện nuôi cấy, điều kiện tối hoàn toàn cho khối lượng củ lớn hơn so với điều kiện 16h sáng/ngày.
Hình 25: Củ lily nuôi cấy trên môi trường CT4 sau 8 tuần
* Nghiên cứu giai đoạn ra ngôi vườn ươm
Củ đưa từ ống nghiệm ra đất đạt tỷ lệ sống cao sẽ quyết định khả năng ứng dụng của kỹ thuật nhân giống bằng phương pháp này vào sản xuất củ giống. Chính vì vậy, chỉ tiêu đầu tiên và quan trọng nhất của khâu này là xác định được giá thể đưa cây từ in vitro ra ngoài vườn ươm. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 68.
Bảng 68: Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng bật chồi và sinh trưởng của củ (sau 4 tuần)
CTTN Tỷ lệ bật chồi (%)
Chiều cao chồi (cm)
Số lá/chồi (lá)
Đường kính củ sau ươm (cm)
CT1 62,3 2,2 1,5 0,7
CT2 53,2 2,5 2,1 0,9
CT3 85,4 3,6 3,3 1,6
CT4 49,4 2,4 1,8 1,2
CT5 80,7 2,8 2,9 1,2
Ghi chú: CT1: Trấu hun + đất phù sa; CT2: Xơ dừa + Trấu hun; CT3: Xơ dừa nghiền nhỏ;
CT4: Đất phù sa; CT5: Xơ dừa + đất phù sa
Kết quả cho thấy CT3 cho kết quả tốt nhất với tỷ lệ bật chồi đạt 85,4%;
đường kính củ sau thu hoạch đạt tới 1,6cm vượt trội so với các công thức khác; đặc biệt các chỉ số về sinh trưởng như chiều cao chồi cũng như số lá trên một chồi đều đạt chỉ số theo dõi cao nhất. Kết quả này cho thấy, củ lily in vitro trong giai đoạn ươm cần được trồng trong môi trường thoáng, xốp giàu oxy. Tuy nhiên phải giữ ẩm và thoát nước tốt.
Hình 26: Củ lily in vitro khi ra ngôi
Nhận xét:
+ Chế độ khử trùng cho vảy củ giống hoa lily Manissa đưa vào nuôi cấy là sử dụng chất khử trùng H2O2 nồng độ 30% với thời gian 15 phút lần 1 và 5 phút lần 2 đã đạt được tỷ lệ mẫu sạch 77%.
+ Môi trường khởi động thích hợp cho tạo củ từ vảy củ giống hoa lily Manissa là: MS + 90g/l sacarose + 0,5mg/l αNAA.
+ Môi trường thích hợp cho nhân nhanh củ in vitro là MS + 90g/l sacarose + 0,5mg/lαNAA + 0,5mg/l BAP và nuôi cấy theo kiểu môi trường đặc.
+ Điều kiện nuôi lớn củ thích hợp là tối hoàn toàn trên môi trường MS bổ sung 120g/l sacarose.
+ Giá thể phù hợp cho sự bật chồi của củ in vitro là xơ dừa nghiền nhỏ.
(Sơ đồ và Quy trình nhân in vitro giống hoa lily Manissa được minh họa ở Phu lục 2-E và 2-F).