2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian: Từ tháng 5/2023 đến tháng 11/2023.
Địa điểm: Tại nhà lưới thuộc Khoa Khoa học sinh học trường Đại học Nông Lâm
TP.HCM và vườn ớt tại Củ Chi
2.2 Nội dung nghiên cứu
Đánh giá kha năng ảnh hưởng của Mycorrhiza lên sự sinh trưởng của cây ớt.
Đánh giá khả năng hạn chế tuyến trùng Meloidogyne spp. Gây hại trên cây ớt của chế phẩm sinh học (AM) ở các mức liều lượng khác nhau trong điều kiện nhà lưới. Các
mức liều lượng thớ nghiệm lần lượt là 2,5ứ/kg đất; 5g/kg đất; 10g/kg đất.
Đánh giá khả năng hạn chế tuyến trùng Meloidogyne spp. Gây hại trên cây ớt của chế phẩm sinh học AM ở điều kiện ngoài đồng ruộng.
2.3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Vật liệu nghiên cứu
2.3.1.1 Đối tượng nghiên cứu
Tuyến trùng có trong đất: Đất được thu tại vùng trồng ớt ở Huyện Củ Chi, TP.
Hồ Chí Minh. Mẫu dat được lay tại 5 điểm theo đường chéo góc xung quanh mẫu bệnh.
Nguồn chế phẩm Arbuscular Mycorrhiza: được cung cấp bởi đề tài “Nghiên cứu sản xuất nam nội công sinh (Arbucular Mycorrhiza — AM) nhằm kiểm soát tuyến trùng và một số nắm bệnh hại trên rau tại TP. Hồ Chí Minh” - (Trương Phước Thiên Hoàng).
2.3.1.2 Vật liệu
Giống ớt (ding nhân nguồn tuyến trùng): Ot Chi Thiên F1 Trang Nông 378 Giống bap (dùng nhân nguồn AM): Bap Ngọt (RADO 236)
Dung cụ thí nghiệm: bình tia, dia petri, cốc đong, rây lọc, ống falcon, lam kính, lamen, micropipet, buồng đếm tuyến trùng, đĩa đếm chia 6, giấy lọc.
Dụng cụ đo đạc: thước, vở, máy ảnh, viét,...
Thiết bi: kinh hiển vi quang học, kinh hiển vi soi nối, may li tâm, cân ddieejn tử, bếp điện, máy khuấy từ.
2.3.2 Khảo sát khả năng kiểm soát tuyến tring Meloidogyne spp. Gây bệnh trên cây ớt của chế phẩm sinh học (AM) ở các mức liều lượng khác nhau trong điều
kiện nhà lưới
Chuẩn bị chậu nhựa 25x20 x20 em, cho đất đã xử lý vào chậu. Hạt ớt được ươm trong khay ươm, đến khi đạt được 4-5 lá thật thì tiến hành chuyên cây ớt ra chậu nhựa đã được chuẩn bị sẵn trong nhà lưới và sẽ được bồ sung chế phẩm sinh học nắm cộng sinh Mycorrhiza đánh giá trên chi Glomus với 10^2 IP/1g chế phẩm (ở mức tỷ lệ 2,5g/kg, 5g/kg, 10g/kg sản phẩm sinh học AM) 10 ngày trước khi lây nhiễm tuyến trùng.
Thí nghiệm đơn yéu tố được bố trí theo khối đầy đủ hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm
5 nghiệm thức, 3 LLL.
Sơ đồ bồ trí thí nghiệm nhà lưới
NT2 NT4 NT5
NT1 NTS NT2
NT3 NT2 NT4
NT4 NT3 NI
NTIS NII NI3
LLLI LLL2 LLL3
NT1: Mẫu chủng tuyến trùng (1000 con/ chậu) và không dùng sản phẩm sinh học (DC+) NT2: Mẫu không chủng tuyến trùng va không dùng chế phẩm sinh học (DC-)
NT3: Mẫu chủng tuyến trùng (1000 con/ chậu) và sử dụng chế phẩm sinh học có chứa AM ở mức liều lượng 2,5g/kg
NT4: Mẫu chủng tuyến trùng (1000 con/ chậu) và sử dụng chế phẩm sinh học có chứa AM ở mức liều lượng 5g/kg
NT5: Mau chủng tuyến trùng (1000 con/ chậu) và sử dụng chế phẩm sinh học có chứa AM ở mức liều lượng 10g/kg
Quy mô thì nghiệm: Tổng số cây thí nghiệm nhà lưới là 30 cây/NT x 3LLL x SNT = 450 cây (6 thí nghiệm 30m”).
Thời gian xử lý chế phẩm sinh học:
Lần 1: Khi trộn đất và ra cây thí nghiệm.
Lần 2: Sau 15 ngày xử lý lần 1.
Thời gian lây nhiễm tuyến trùng: Sau 10 ngày xử lí chế phẩm sinh học lần 1.
Thời gian theo doi: 7, 14, 21, 28 ngày sau khi chủng tuyến trùng.
e Đánh giá các chỉ tiêu sinh trưởng của cây
Các chỉ tiêu theo dõi ở từng thời điểm bao gồm:
Các chỉ tiêu sinh trưởng: chiêu cao cây, sô lá, chiêu dài rễ, SỐ lượng ré, sinh khôi rễ (bộ rễ tươi thu được).
+ Chiều cao cây: đo từ điểm giao giữa rễ và thân lên đến đỉnh sinh trưởng cao nhất.
+ Số lá: đếm số lá cấp 1 trên thân chính có cuống lá và phiến lá.
+ Chiều dai rễ: đo từ điểm giao nhau giữa rễ và thân đến chop rễ dài nhất.
+ Số lượng rễ: đếm số rễ cấp 1.
+ Sinh khối rễ: cân rễ tươi.
Tỉ lệ nam cộng sinh (%) = (Tổng số đoạn rễ hiện điện AM / Tổng số đoạn rễ quan
sát) x 100
Tỷ lệ bệnh: Quan sát rễ có biêu hiện của u sưng TẾ, tỷ lệ bệnh được tính theo công
thức sau:
Tỷ lệ rễ bệnh (%) = (Số rễ bệnh / Tổng sé rễ) x 100
Chỉ tiêu về tuyến trùng: ở mỗi nghiệm thức nhồ 2 cây, với 3 LLL tương đương nhé 6 cây dé theo dõi.
Cây ớt được nhồ lên, rửa nhẹ bộ rễ với nước sạch, cắt và cân trọng lượng rễ, sau đó cân 2 — 5g rễ dé lay chỉ tiêu:
Số lượng u sưng/ bộ rễ: rễ được cắt nhỏ và trộn đều rồi chọn ngẫu nhiên 1g rễ (lặp lại 2 lần trên 1 bộ rễ) dé đếm số lượng u sưng. Số lượng u sưng trên bộ rễ dùng dé đánh giá mức độ man cảm của cây cà chua đối với loài Meloidogyne spp. Theo thang đánh giá của Taylor và Sasser (1978) với 6 cấp độ đánh giá:
e Cấp độ bệnh
Cấp 0: Không có u sưng trên bộ rễ Cấp 1: Từ 1 — 2 u sưng trên bộ rễ Cấp 2: Từ 3 — 10 u sưng trên bộ rễ Cấp 3: Từ 11 — 30 u sưng trên bộ rễ Cấp 4: Từ 31 — 100 u sưng trên bộ rễ Cấp 5: Trên 100 u sưng trên bộ rễ 2.3.3.1 Lây nhiễm nhân tạo
Thu rễ cây ớt sau 45 ngày, rửa với nước sạch, cắt rễ từ 1 -2 cm, sau đó cho vào 1 lít nước cất chứa dung dịch Zorox 0.7 % lắc đều, ngâm trong 3 phút. Lọc phần nước qua ray lọc, các ray có đường kính lỗ ray lần lượt là 25 um, 50 wm. Rửa nhiều lần với nước
cât.
Trứng và tuyến trùng J2 được giữ lại trên màng rây 25 m. Dùng bình nước cất rửa lai mang ray lọc 25 ym, thu được bọc trứng và tuyến trùng vào cốc thuỷ tinh, tiếp tục cho thêm 40 ml nước cất có chứa dung dịch Zorox 0.7%, ngâm trong 10 phút, sau
cùng lọc lại phần dung dịch chứa trứng và tuyến trùng cảm nhiễm J2 với 2 rây lọc với kích thước lần lượt là 25 m và 50 m, sau đó rửa lại với nước cất 5 lần.
Trứng và tuyến trùng J2 được giữ lại trên mang ray 25 pm đã lót giấy lọc chuyên dụng, đặt rây lọc vào đĩa petri, lọc. Ủ trứng từ 4 — 5 ngày trong tối, ở nhiệt độ phòng, tuyến trùng J2 nở di chuyền qua các lớp giấy lọc chuyên dụng và lưới rây lọc xuống bên dưới, sau 4-5 ngày thu được nước chứa tuyến trùng J2 phục vụ cho công tác nghiên cứu tiếp theo.
Tuyến trùng J2 sau khi thu được tiễn hành lây nhiễm bệnh nhân tạo bằng cách xới nhẹ lớp đất mặt trên mỗi chậu, tưới dịch tuyến trùng được đếm và duy trì dinh dưỡng
và chăm sóc cây.
2.3.2.3 Đánh giá mật số bào tử AM trong đất
Thu bảo tử nam cộng sinh từ trong đất theo kỹ thuật sàng ướt (wet sieving) kết
hợp với phương pháp ly tâm trong dung dịch sucrose 50% ( Brundrett, 1996):
Bước 1: Cân 50g đất, Loại bỏ các hạt đá to và rác thô trong mau đất sau đó cân 50g đất, sau đó cho vào cốc cho 500ml nước, khuấy đều và đề lắng trong khoảng 30
phút.
Bước 2: Khuấy đều dung dịch đất rồi để yên khoảng 1 phút cho các thành phần đất to lắng xuống, sau đó lọc dung dịch đất qua rây lọc có kích thước lỗ rây lần lượt là 500 um và 40 pm, rửa dưới vòi nước cho đến khi nước đi qua ray không còn màu đục.
Bao tử nam sẽ được giữ lại trên ray lọc có kích thước lỗ 40m.
Bước 3: Thu phan đất trên sàng 40 ym cho vào khoảng 1/3 ống falcon thé tích 50 ml, sau đó thêm 2/3 dung dich sucrose 50% lắc đều.
Bước 4: Tiến hành ly tâm với tốc độ là 2000 vòng/phút trong 5 phút.
Bước 5: Sau ly tâm, tiến hành thu phan dich nổi, bao tử nam nằm trong dich sucrose . Lọc qua lỗ ray có kích thước 40 wm và rửa lại bằng nước loại bỉ hết phan
đường sucrose.
Bước 6: Thu lại bào tử trên rây, sau đó đem quan sát và đếm mật số bao tử dưới kính soi nối.
Quan sát tiêu ban bao tử nam nội cộng sinh rễ. Bào tử nam AM sau khi ly tâm được nhuộm qua thuốc nhuộm PVLG + thuốc thử Melzers khoảng 5 phút. Quan sát và ghi nhận lại cấu trúc và các chi nắm AM dưới kính hién vi. Các tiêu bản được quan sát dưới kính hiển vi quang học ở vật kính 40X và mô tả kích thước, mau sắc, hình dạng, số lớp của thành bao tử, hình dạng cuống bào tử (nếu có) của bảo tử AM dựa vào các mô tả của Brundrett và cộng sự (1996) kết hợp với INVAM để mô tả loài.
2.3.3 Đánh giá khả năng kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne spp. gây bệnh trên cây ớt của chế phẩm sinh học có AM ở điều kiện ngoài đồng ruộng
Từ kết quả của nội dung thí nghiệm trong nhà lưới, bố trí thí nghiệm hoan toàn ngẫu nhiên (Randomized Complete Block Design — RCBD), đơn yếu tố với 3 lần lặp lại trên 5 nghiệm thức. Để tìm ra liều lượng AM phù hợp để kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne spp. => Tién hành thực hiện thí nghiệm ngoài đồng ruộng.
Bồ trí thí nghiệm ngoài đồng ruộng theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố.
Thí nghiệm gồm 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại gồm 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 2 lip, mỗi nghiệm thức gồm 40 cây. Tổng cây thí nghiệm là 480 cây.
Sơ đồ bó trí thí nghiệm
LLL1 LLL2 LLL3
NTI | NT2 | NT3 | NT4 | NT3 | NT1 | NT4 | NT2 | NT3 | NT2 | NT1 | NT4
Thi nghiệm trên đồng ruộng.
NT1:; Mẫu sử dung sản phẩm vi sinh thị trường của Viện Thổ nhưỡng nông hóa với liều lượng theo khuyến cáo nhà sản xuất.
NT2: Mau sử dụng sản pham hóa học VELUMprime 400SC với mức liều lượng phun
theo khuyên cáo nhà sản xuât.
NT3: Mẫu sử dụng chế phẩm vi sinh có chứa AM với mức liều lượng dựa trên thí
nghiệm của Nội dung 1.
NT4: Mẫu đối chứng (nguồn tuyến trùng có sẵn trong đất tại vườn, được đánh giá mật số tuyến trùng trước khi thí nghiệm). (ĐC+)
Quy mô thí nghiệm
Tổng số cây thí nghiệm đồng ruộng là 40 cây/NT x 3LLL x 4NT = 480 cây (6 thí nghiệm 30m’).
Thời gian theo doi: I0NXL Lần 1, TXL Lần 2, 1ONXL Lần 2, 20 NXL Lần 2.
Thời gian xử lý chế phẩm sinh học:
Lần 1: Khi ra cây thí nghiệm.
Lần 2: Sau 15 ngày xử lý lần 1.
= Chỉ tiêu theo dõi:
Chỉ tiêu sinh trưởng: chiều cao cây, số lá, số rễ, chiều dài rễ, sinh khối rễ.
+ Chiêu cao cây: đo từ điểm giao giữa rễ và thân lên đên đỉnh sinh trưởng cao nhất.
+ Số lá: đếm số lá cấp 1 trên thân chính có cuống lá và phiến lá.
+ Chiều đài rễ: đo từ điểm giao nhau giữa rễ và thân đến chóp rễ dài nhất.
+ Số lượng rễ: đếm sé rễ cấp 1.
+ Sinh khối rễ: cân rễ tươi.
Chỉ tiêu tuyến trùng: mật số tuyến trùng trong đất (50g dat) và trong rễ (2 -5g rễ);
số u sưng trên toàn bộ rễ; cap độ tổn thương của bộ rễ (dựa vào số u sưng).
Chỉ tiêu về nam nội cộng sinh (AMF): mật số bao tử nam AM (100g dat); tỷ lệ cộng sinh của nam AM (trén 100 doan ré quan sat).
Hiệu lực thuốc (%): Hiệu lực thuốc được tính theo công thức Henderson-Tilton
E(%)= [1-(CTa x Cb)/(Tb x Ca)] x 100 Trong đó: E: Hiệu lực khảo nghiệm
Ta: Mật độ tuyến trùng ở công thức xử thuốc tại thời điểm sau xử lý Tb: Mật độ tuyến trùng ở công thức xử lý thuốc tại thời điểm trước xử lý
Ca: Mật độ tuyến trùng ở công thức đối chứng tại thời điểm sau xử lý Cb: Mật độ tuyến trùng ở công thức đối chứng tại thời điểm trước xử lý
2.3.4 Phương pháp nghiên cứu
2.3.4.1 Phương pháp lọc tuyến trùng trong đất
Tách chiết tuyến trùng bằng phương pháp khay Whitehead.
Bước 1: dùng khay lọc (kích thước lỗ 85 um) đặt lên dia petri, và lót 1 lớp khăn giấy mỏng lên khay lọc.
Bước 2: cân 50g đất cho lên khăn giấy.
Bước 3: cho nước vào 4m đều phần đất, sao cho nước duéi dia petri cham dén lớp khăn giấy.
Bước 4: sau 24-48 giờ, thu phan dich dưới dia petri có chứa tuyến trùng.
Cách đếm tuyến trùng.
Lắc đều phần dịch thu được, sau đó lấy 3ml cho vào đĩa đếm tuyến trùng, xem dưới kính hiển vi quang học 10X, trên khây đếm tuyến trùng được chia thành 406 6 vuông bằng nhau, có thể đếm toàn bộ các ô hoặc đếm các ô đại điện (20 ô), tính trung bình mật số hiện diện trên 1 6 và nhân vơi st6ng số ô trên khây. Có công thức tính như
sau.
n xV tổng x406 V đếm x20
Mật số tuyến trùng =
Trong đó:
n: số tuyến trùng ký sinh đếm được.
V tông: thể tích dịch chiết thu được.
V đếm: thé tích dịch chiết đếm trên khây.
406: ô hiện diện trên khây đếm tuyến trùng.
20: số ô đếm đại điện cho mẫu dịch chiết.
2.3.4.2. Nhận diện tuyến trùng ký sinh trong mô thực vật.
Phương pháp nhuộm tuyến trùng trong mô thực vật theo Bybd và ctv (1983) có cải tiến. Chuan bị thuốc nhuộm bao gồm: dung dịch Lactoglycerol (Acid lactic : Glycerol : Nước cat theo tỉ lệ (1:1:1) bé sung acid Fushin 0.5%.
Mô thực vật chứa ky sinh được rửa nhẹ dé loại bỏ dat cát, sau đó cắt thành những
đoạn nhỏ khoảng lcm, ngâm trong dung dịch NaClO 1% (được pha loãng từ dung dịch
Javen 5%) từ 3-5 phút và rửa lại với nước. cho mẫu đã rửa sạch vào ống falcon chứa thuốc nhuộm đun sôi trong 3-5 phút và dé nguội, rửa sạch với nước. Cuối cùng ngâm rễ trong dung dich Acid Lactic : Acid Acetic : Nước cat có tỉ lệ 1:1:1. Tuyến trùng ký sinh và túi trứng sẽ bắt màu thuốc nhuộm (màu hồng), mô thực vật hầu như trong suốt. Quan sát mẫu nhuộm dưới kính hiển vi.
2.3.4.3. Phương pháp nhân nguồn tuyến trùng.
Thu thập nguồn đất bị nhiễm tuyến trùng.
Chuẩn bị chậu, giá thể và giống ớt.
Tiền hành trồng ớt vào chậu và lây nhiễm trực tiếp mẫu đất bị nhiễm tuyến trùng vào chậu ớt dé nhân nguồn. Sau 40 ngày sau khi lây nhiễm, tiến hành thu đất trong chậu mang đi kiểm tra mật số tuyến trùng và làm nguồn lây nhiễm chính trên cây ớt thí
nghiệm.
2.3.4.4 Xử lý số liệu
Các số liệu được xử lý sơ bộ bằng Microsoft Excel 2016 và phân tích thống kê ANOVA các chỉ tiêu theo doi một yếu tố bằng phần mềm SAS 9.1.
CHƯƠNG III