DANH SÁCH CÁC HÌNH
CHUONG 4. KET QUA VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết qua
4.1.1. Độ 4m bột, hiệu suất chiết và độ âm cao chiết Kết quả được trình bày trong bảng 4.1.
Bảng 4.1. Kết quả đo độ 4m bột, hiệu suất chiết và độ âm cao chiết
Mẫu Độ am bột (%) Hiệu suất chiết (%) Độ âm cao chiết (%)
Non 5,83 + 0,09 2381+0,11 11,70 + 0,09 Trưởng thành 6,30 + 0,17 16,51 + 0,11 9,11 + 0,02
Gia 5,67 + 0,12 17,94 + 0,18 12,55+0,01
Kết quả được thé hiện dưới dang giá trị trung bình (+ SEM) của ba lan lặp lại.
4.1.2. Dinh tính một số nhóm hợp chat có trong dịch chiết từ thân cây Kết quả được trình bày trong bảng 4.2.
Bảng 4.2. Kết quả định tính một số nhóm hợp chất có trong dịch chiết từ thân cây Mau
Nhóm hợp chất Thuốc thử/ Phan ứng
Non Trưởng thành Già Alkaloid Dragendorff + + + Flavonoid NaOH 10% ++ ++ + Polyphenol FeCl; 5% ++ ++ + Triterpenoid Liebermann — Burchard ++ + ++
Saponin Lac tao bot _ _ _
Đường khử Fehling ++ ++ fats Chú thích: +++: Phản ứng dương tính rất rõ; ++: Phan ứng dương tính rõ; +: Phản ứng
dương tính; —: Phản ứng âm tính.
Kết quả định tính cho thấy trong thân cây xương rồng Nopal ở cả ba giai đoạn non, trưởng thành và già đều có sự hiện diện của các nhóm hợp chất như alkaloid,
flavonoid, polyphenol, triterpenoid và đường khử, nhưng không có chứa saponin.
Kết quả của các thí nghiệm định tính được thể hiện từ hình 4.1 đến 4.6.
Hình 4.1. Dịch chiết cồn ban đầu dé so sánh định tính. (N) Non; (T) Trưởng thành;
(G) Già.
Hình 4.3. Dinh tinh flavonoid. (N) Non;
(T) Trưởng thành; (G) Già.
N G T |
—_—— `
Hinh 4.5. Dinh tinh triterpenoid. (N) Non; (T) Trưởng thành; (G) Gia.
T
Hình 4.2. Định tính alkaloid. (N) Non;
(1) Trưởng thành; (G) Già.
Hình 4.4. Dinh tinh polyphenol. (NV) Non; (T) Trưởng thành; (G) Già.
Hình 4.6. Dinh tính đường khử. (N) Non; (T) Trưởng thành, (G) Già.
4.1.3. Định lượng flavonoid và polyphenol tổng số
16
4.1.3.1. Định lượng flavonoid tổng số
Bang 4.3. Tương quan giữa nồng độ quercetin và độ hap thu
Nồng độ quercetin (j1g/mL) 20 40 60 80 100 Độ hấp thu (Abs 415 nm) 0,108 0,238 0,364 0,489 0,615
Phương trình đường chuẩn: y =0,0063x — 0,017 R?=0,9999
Đường chuẩn quercertin
0,700
sens y= 0,0063x - 0,017 `
R* =0,9999 a
0,500
= Ẳ
=
m 0,400 = xo ed
= 0,300
‹œ- ST
a ed
0,200
0,100 e
0,000
o 20 40 60 80 100 120 Nong độ quercertin (ug/mL)
Hình 4.7. Đường chuẩn quercetin (20 — 100 g/mL).
Dựa vào kết quả từ bảng 4.3 và hình 4.7, xây dựng được phương trình hồi quy tuyến tính y = 0,0063x — 0,017 (trong đó: y là độ hấp thu ở bước sóng 415 nm, x là nồng độ của chất chuẩn quercetin (ug/mL)) thé hiện mối quan hệ tương quan giữa độ hap thu và nồng độ quercetin với hệ số tương quan R? = 0,9999 > 0,95 là đáng tin cậy. Từ đó, xác định được hàm lượng flavonoid ở trong các mẫu dich chiết.
Phân tích ANOVA 1 yếu tố bang phần mềm Minitab. I6, được kết quả như bang
sau:
Bảng 4.4. Hàm lượng flavonoid có trong mẫu
Mẫu Non Trưởng thành Già P - value
Ham luong
flavonoid 3,159°+ 0,02 4,6737+0,01 4,013°+0,01 0,000 (mgQE/g)
Các giá trị trung bình có kí tự theo sau khác nhau có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thông kê
(P < 0,05).
Từ kết qua ở trên bảng 4.4, với giá trị P — value = 0,000 < 0,001 < 0,05 thay duoc rang hàm lượng flavonoid giữa các mẫu dich chiết có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê. Mẫu thân ở giai đoạn trưởng thành chứa hàm lượng flavonoid nhiều nhất với 4,673 mgQE/g, tiếp đến là ở giai đoạn già có 4,013 mgQE/g và thấp nhất là ở giai đoạn
non với 3,159 mgQE/g.
4.1.3.2. Định lượng polyphenol tổng số
Bảng 4.5. Tương quan giữa nồng độ gallic acid và độ hấp thu Nong độ gallic acid
10 20 30 40 50 60
(ug/mL)
D6 hap thu (Abs 760
0,115 0,215 0,318 0,426 0,536 0,648 nm)
Phương trình đường chuẩn: y = 0,0107x + 0,0027 R?=0,9995
Đường chuẩn gallic acid
0,7
- y = 0,0107x + 0,0027 Pri , R? = 0,9995
2 0,5 =
"04 - xO
-C 03 s
<O-
a 02 ỉ 0,1 ©
0
0 10 20 30 40 50 60 70
Nồng độ gallic acid (ug/mL)
Hình 4.8. Đường chuẩn gallic acid (10 — 60 pg/mL).
Kết quả từ bảng 4.5 và hình 4.8, có được phương trình hồi quy tuyến tính y = 0,0107x + 0,0027 (trong đó: y là độ hấp thu ở bước sóng 760 nm, x là nồng độ của chất chuẩn gallic acid (ug/mL)) thé hiện mối quan hệ tương quan giữa độ hấp thu và nồng độ gallic acid với hệ số tương quan R? = 0,9995 > 0,95 là đáng tin cậy. Từ đó, xác định được hàm lượng polyphenol có trong các mẫu dịch chiết.
18
Phân tích ANOVA 1 yếu tố bang phần mềm Minitab. I6, được kết quả như bang
sau:
Bảng 4.6. Hàm lượng polyphenol có trong mẫu
Mau Non Truong thanh Gia P - value
Ham luong
polyphenol 5,915°+ 0,02 8,924*+0,03 7,326>+ 0,05 0,000
(mgGAE/g)
Các giá trị trung bình có kí tự theo sau khác nhau có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê
(P < 0,05).
Từ kết qua ở bang 4.6, với giá tri P — value = 0,000 < 0,001 < 0,05 thay được rang hàm lượng polyphenol giữa các mẫu dich chiết có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê. Mẫu thân ở giai đoạn trưởng thành chứa hàm lượng polyphenol nhiều nhất với 8,924 mgGAE/g, theo sau là ở giai đoạn già có 7,326 mgGAE/g và thấp nhất
là ở giai đoạn non với 5,915 mgGAE/g.
4.1.4. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa
Từ kết quả đo độ hấp thu ở bước sóng 517 nm, xác định được hoạt tinh chống
oxy hóa (IC) cua ascorbic acid.
Đường chuẩn ascorbic acid
90,0
= y = 2,1489x - 4,4193 _ 70,0 = 0,99972 —
60,0 oe
% 50,0 oo
40,0 _„—
30,0 = 20,0
10,0 0,0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Nồng độ ascorbic acid (ug/mL)
)
IC (
Hình 4.9. Đường chuẩn ascorbic acid (5 — 40 pg/mL).
Kết qua từ hình 4.9, có được phương trình hồi quy tuyến tính y = 2,1489x — 4.4193 (trong đó: y là hoạt tính chống oxy hóa, x là nồng độ của chất chuẩn ascorbic acid (ug/mL)) thé hiện mối quan hệ tương quan giữa hoạt tính chống oxy hóa và nồng
độ ascorbic acid với hệ số tương quan R? = 0,9997 > 0,95 là đáng tin cậy. Từ đó, suy
ra [Cso cua ascorbic acid là 25,324 + 0,297 ug/mL.
Giá trị ICso của các mẫu cao chiết (non, trưởng thành và già) được thực hiện
tương tự như trên và được trình bày ở bảng sau:
Bảng 4.7. Kết quả xác định ICso của các mẫu cao chiết
Mẫu Phương trình hồi quy ICso (ug/mL)
Non y = 0.2097x - 26.445 R?= 0.9995 364,545 + 0,201 Trưởng thành = y = 0.2127x - 19.402 R? = 0.9996 326,291 + 0,422 Gia y = 0.2047x - 20.230 R? = 0.9993 343,087 + 0,461
Hình 4.10. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn. a) S. aureus; b) E. coli. (+) Đối chứng
dương: Gentamicin; (—) Đối chứng âm: DMSO 5%, (N): Mẫu non; (T): Mẫu trưởng thành;
(G): Mẫu già.
Dựa vào hình 4.10, có thể thấy đối chứng đương kháng sinh gentamicin đều có khả năng kháng tốt với cả hai loài vi khuẩn S. aureus và E. coli. Cả ba mẫu cao chiết ở
các giai đoạn non, trưởng thành và già chỉ cho kha năng kháng được với S. aureus, còn E. coli thì không.
Đường kính vòng vô khuẩn của các mau cao chiết và đối chứng dương gentamicin đối với S. aureus được thê hiện trong bang 4.8 dưới đây.
20
Bang 4.8. Kết quả đường kính vòng vô khuan của mẫu đối với S. aureus Chat Trưởng
Gentamycin Non Gia P - value khao sat thanh
Duong kinh
vòngvô 17,102+0,15 10,2744 0,23 15,33°4+0,18 13,47°+ 0,09 0,000 khuẩn
(mm)
Các giá trị trung bình có kí tự theo sau khác nhau có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê
(P < 0,05).
Từ kết quả trên, giá tri P — value = 0,000 < 0,001 < 0,05 cho thấy kha năng kháng khuẩn giữa các mẫu cao chiết với nhau và so với kháng sinh gentamicin có sự khác biệt rat có ý nghĩa về mặt thống kê đối với Š. aureus. Trong ba mẫu cao chiết thì mẫu thân ở giai đoạn trưởng thành cho đường kính vòng kháng lớn nhất là 15,33 mm và thấp nhất
là 10,27 mm của mẫu thân ở giai đoạn non.
Đối với E. coli, chỉ có kháng sinh gentamicin là thấy xuất hiện vòng vô khuẩn
với đường kính 14,87 + 0,29 mm.
4.2. Thảo luận
4.2.1. Độ 4m bột, hiệu suất chiết và độ 4m cao chiết
Trong quá trình bảo quản bột nguyên liệu thì độ am của bột được xem là một trong những tiêu chí quan trọng dé đánh giá. Trong nghiên cứu này, độ âm của các mẫu bột ở ba giai đoạn non, già, trưởng thành được xác định lần lượt là 5,83%; 6,30% và 5,67% đạt ngưỡng an toàn dé bảo quản mẫu với độ âm < 13% theo tiêu chuẩn của Dược điển Việt Nam V (2017). Độ am càng thấp hạn chế được hoạt động của các vi sinh vật phân giải hay nắm men, nắm mốc gây hư hại ảnh hưởng đến thành phần hoạt chất có trong mẫu.
Hiệu suất chiết cao đạt được là 23,81%; 16,51%; 17,94% và cao chiết thu được có độ am là 11,7%; 9,11%; 12,55%, tương ứng với ba mẫu ở các giai đoạn non, trưởng thành và già. Với độ âm của cao chiết như trên là đạt chuẩn an toàn theo tiêu chuẩn của Dược điển Việt Nam V đối với cao thuốc đặc (< 20%).
4.2.2. Dinh tính một số nhóm hợp chat có trong dịch chiết từ thân cây
Từ kết quả định tính ở bảng 4.2, cho thay có sự hiện diện của các nhóm hop chất
có hoạt tính sinh học như alkaloid, flavonoid, polyphenol, triterpenoid và đường khử
trong cả ba mẫu thân ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau non, trưởng thành và già.
Kết quả định tính này tương đồng với nghiên cứu của Msaddak và ctv (2017) và Tạ Thu Hang (2018).
4.2.3. Định lượng flavonoid và polyphenol tong số
Kết quả từ bảng 4.5 và bảng 4.6 cho thấy mẫu thân ở giai đoạn trưởng thành cho hàm lượng flavonoid tổng số va polyphenol tổng số cao nhất lần lượt là 4,673 mgQE/g và 8,924 mgGAE/g. Tiếp đến là mẫu thân ở giai đoạn già với hàm lượng flavonid tổng số là 4,013 mgQE/g và hàm lượng polyphenol tông số là 7,326 mgGAE/g. Thấp nhất là mẫu thân ở giai đoạn non với hàm lượng flavonoid tổng số và polyphenol tổng số lần
lượt là 3,159 mgQE/g và 5,915 mgGAE/g.
So sánh kết quả với một vài nghiên cứu đã được công bố trước đây như theo ông Lee và ctv (2002) đã xác định được hàm lượng polyphenol tổng số rất cao tới 180,3 mg GAE/g. Hàm lượng flavonoid và polyphenol tổng số của xương rồng Nopal được trồng ở Ma rốc lần lượt là 22 — 27 mgQE/g và 73,1 — 111,2 mgGAE/g (Allai va ctv, 2017).
Nghiên cứu của Nguyễn Thị Thùy Dung và ctv (2018) cũng đều cho hàm lượng flavonoid và polyphenol tông số cao nhất ở mẫu thân giai đoạn trưởng thành, lần lượt là 0,168 + 0,012 mgQE/g và 2,96 + 0,163 mgGAE/g. Kết quả nghiên cứu của Tạ Thu Hang (2018) về hàm lượng polyphenol tông số của cao chiết ethyl acetat của thân xương rồng Nopal giống Jalpa là 8,726 + 0,103 mgGAE/g, tương đồng với kết quả ở trên. Sự chênh lệch về hàm lượng flavonoid và polyphenol tổng số giữa các nghiên cứu có thé là do sử dụng các phương pháp chiết và dung môi chiết khác nhau.
Từ đó, có thé thay thành phần hóa học của xương rồng Nopal phụ thuộc vào nhiều yếu tô như giống, điều kiện môi trường chang hạn như điều kiện khí hậu và thé nhưỡng, quản lý cây trồng bao gồm bón phân, xử lý sau thu hoạch và giai đoạn sinh trưởng của
cây.
4.2.4. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa
Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa cho thấy cả ba mẫu thân đều thê hiện hoạt tính chống oxy hóa, lần lượt là ở giai đoạn trưởng thành > già > non tương ứng với
các giá trị ICso là 326,291 g/mL < 343,087 ug/mL < 364,545 ug/mL. Tuy nhiên, khi
so sánh với giá trị ICso của chất chuẩn ascorbic acid thì hoạt tính chống oxy hóa của mẫu
22
thấp hơn khoảng 13,0 — 14,4 lần. Từ lau ascorbic acid đã được biết đến là một chất chống oxy hóa mạnh nên việc mẫu thân xương rồng Nopal có hoạt tính chống oxy hóa thấp hơn là dễ hiểu.
Hàm lượng flavonoid và polyphenol tổng số cũng ảnh hưởng chặt chẽ đến hoạt tính chống oxy hóa. Flavonoid đóng vai trò don dẹp các gốc tự do (ROS, RNS....) nhờ vào số lượng và sự sắp xếp của các nhóm phenolic hydroxyl gắn vào cấu trúc vòng của chúng. Bằng cách vận chuyên một electron cho chất oxy hóa chủ yêu phụ thuộc vào khả năng khử của các gốc tự do và khả năng tiếp cận gốc tự do của chúng (Rice-Evans,
2001).
Khi so sánh với một số cây dược liệu khác như lá cây chùm ngây (Moringa oleifera) có ICso = 537 g/mL (Phan Thi Bích Trâm và Nguyễn Thị Diễm My, 2016), dịch chiết nước của lá cây Lá dong (Phrynium parviflorum Roxb, Marantaceae) có ICso
= 419,61 pg/mL (Hoàng Thi Phương Liên, 2018), cây xa lách xoong (Nasturtium microphyllum) có ICso trong khoảng từ 493,40 — 960,83 ug/mL (Huynh Ngoc Trung
Dung va ctv, 2021), dich chiết ethanol 100% của lá Bưởi bung (Acronychia pedunculata (L.) Miq.) với ICso = 612,9 + 12,9 g/mL (Phùng Thị Tuyến va ctv, 2021),... thì hoạt tính chống oxy hóa của thân xương rồng Nopal cao hơn từ 1,3 — 2,9 lần. Từ đó, có thé thấy răng mẫu thân xương rồng Nopal cũng có hoạt tính chống oxy hóa cao so với một số loài cây trong tự nhiên. Có tiềm năng trở thành nguồn nguyên liệu chiết chất chống oxy hóa tự nhiên và được ứng dụng nhiều vào trong các thực phẩm chức năng.
4.2.5. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn
Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cả ba mẫu cao chiết ở nồng độ 50 mg/mL đều cho khả năng kháng mạnh với Staphylococcus aureus với đường kính vòng vô khuẩn lần lượt là mẫu thân ở giai đoạn trưởng thành: 15,33 mm > giả: 13,47 mm >
non: 10,27 mm, nhưng không kháng được Escherichia coli. Vòng vô khuẩn thể hiện rất rõ ràng và có thé nhìn thấy bằng mắt thường.
Trong thân cây xương rồng ở cả ba giai đoạn non, trưởng thành và già đều có sự hiện diện của các hợp chất alkaloid, flavonoid và polyphenol đều được chứng minh có hoạt tính kháng khuẩn. Hoạt tính kháng khuẩn của polyphenol diễn ra theo cơ chế bat hoạt các enzyme trong tế bao vi khuẩn. Flavonoid thông qua ức chế tổng hợp nucleic acid làm thay đối chức năng màng và thành tế bao vi khuẩn bang cách ức chế tong hợp
lớp phospholipid của màng và thành peptidoglican (Farhadi và ctv, 2019).
Dựa vào đường kính vòng vô khuẩn, có thể thay khả năng kháng S. aureus của mẫu cao chiết thân xương rồng Nopal ở giai đoạn trưởng thành so với đối chứng dương gentamicin là gần như tương đồng nhau. Chứng tỏ, mẫu thân có khả năng kháng khuẩn rất mạnh đối với S. aureus. Tuy nhiên, mẫu lại không thé hiện sự kháng đối với E. coli.
Có thé là do chủng E. coli này quá mạnh nên cần phải tăng nồng độ mau cao chiết cao hon dé thử nghiệm lại.
24