DANH SÁCH CÁC HÌNH
CHUONG 3. VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian: thí nghiệm được nghiên cứu từ ngày 01/08/2022 đến 20/12/2022
Địa điểm: phòng Công nghệ tế bào thực vật — Khoa Công Nghệ sinh học, trường đại học Nộng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu nghiên cứu
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Vật liệu ban đầu dùng làm mẫu để nhân giống là cây Trau Bà Nam Mỹ được thu
thập từ các nhà vườn trên đường Phạm Văn Đồng, TP Hồ Chí Minh sau đó được nuôi
dưỡng và xử lí nắm bệnh trong 2 tuần tại nhà lưới của Khoa Khoa học Sinh học, trường Đại học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh.
3.2.2. Hóa chất và môi trường nuôi cấy
Các hóa chất sử dụng: xà phòng, cồn, javel, tween 20, các chất khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin, các chất hữu cơ, đường, agar. Ngoài ra còn sử dụng các chất điều hòa
sinh trưởng auxin, cytokinin.
Môi trường nuôi cấy: Môi trường dinh dưỡng MS (Musakige va Skoog, 1962) bố sung
30 g/l đường saccarose, 6,5 — 8 g/l agar.
Giá trị pH của môi trường nuôi cấy trước khi khử trùng là: 5,7 — 5,8. Hap khử trùng bang autoclave ở áp suất 1 atm, 121 °C trong 20 phút.
3.2.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
Thiết bị: tủ cấy vô trùng, cân phân tích, máy do pH, nồi hấp khử trùng, thiết bị chiếu
xạ cobalt 60.
Dụng cụ: dao cấy, kẹp, đĩa petri, đèn côn, ống nghiệm, chai thủy tinh 500ml, ống đong, micropipep, đũa thủy tinh và các dụng cụ cần thiết khác trong phòng nuôi cấy mô.
3.2.4. Điều kiện nuôi cấy
Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ ngày Cường độ chiếu sáng: 10 — 15 w/m?/s Nhiệt độ phòng nuôi cấy: 25 + 3 °C
16
Độ âm: 55 — 75 %
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Nội dung 1: Tao vật liệu cho xử lí chiếu xa tia gamma (“Co) trong điều kiện in
vitro
3.3.1.1. Tái sinh chéi cây Trầu bà Nam Mỹ từ mẫu cấy ban đầu Mục tiêu: tái sinh chồi cây Trầu bà Nam Mỹ từ mẫu cấy ban đầu.
Cách tiến hành: chọn những đoạn thân của cây Trầu bà Nam Mỹ chứa chồi nách lá thứ hai, thứ 3 tính từ đỉnh xuống, phát triển tốt, màu xanh non, khỏe mạnh và không bị bệnh.
Các đoạn thân này sẽ được loại bỏ lá, cắt thành kích thước nhỏ từ 3 — 4 cm. Dat mẫu dưới vòi nước chảy nhẹ khoảng 15 phút nhằm bỏ một phan vi khuẩn, nam bám trên bề mặt mẫu, tránh làm tôn thương đến chôi. Sau đó hòa vào xà phòng và lắc nhẹ mau trong vòng 15 phút rồi rửa lại nhiều lần cho đến khi sạch xà phòng. Tiếp theo sẽ thực hiện trong tủ cấy, lắc mẫu với cồn 70° trong 1 phút, rửa sạch mẫu bằng nước vô trùng 3 lần (3 — 5 phút trên/ lần). Sau đó xử lí javel lần 1 bằng cách ngâm ngập mẫu trong dung dịch javel nồng độ 20% trong 20 phút cùng với 2 giọt tween 80. Rửa lại bằng nước vô trùng 3 lần.
Tiếp tục xử lí Javel lần 2 trong vòng 15 phút ở nồng độ 30%. Rửa lại bằng nước vô trùng 3 lần. Sau đó lắc mẫu với kháng sinh (tetracyline:amoxcyline = 1 : 1) trong vòng 30 phút.
Cuối cùng, rửa lại mẫu 3 lần với nước vô trùng. Mẫu sau khi đã khử trùng sẽ được cắt thành từng đoạn 2 — 3 em chứa chồi và cấy nằm ngang trên môi trường MS cơ bản.
3.3.1.2. Nhân nhanh chồi
Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ BA và IAA đến khả năng nhân nhanh chdi.
Cách tiến hành: chọn các mẫu chồi sống sạch sau khi tái sinh chồi tiến hành cấy vào môi trường MS cơ bản có chứa 30 g/1 saccharose, 8 g/l agar và bố sung BA + IAA dé nhân nhanh chồi với các nồng độ được bồ trí như thí nghiệm ở bảng 3.1
Bồ trí thí nghiệm: bố tri theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố với 4 nghiệm thức, 3 lần lặp lại. Mỗi nghiệm thức được cây 9 mẫu, 3 mẫu được cay vào | bình môi trường MS cơ bản chứa 30 g/1 saccharose, 8 g/ agar bồ sung 3mg/1 BA. Tổng số mẫu là 108 mẫu.
17
Bảng 3.1. Khảo sát ảnh hưởng của BA và IAA đến khả năng nhân nhanh chồi Nghiệm thức Chat điều hòa sinh trưởng (mg/1) Số Tổng số mẫu
mẫưNT (3 lần lặp lại)
BA IAA
Al 0 0,2 9 27 A2 1 0,2 9 27 A3 2 0,2 9 a7 A4 3 0,2 9 %
Quan sát sau 30 ngày nuôi cây:
Số chi trung bình hình thành / mẫu (chồi) = tổng số chỗi hình thành/ tổng số mẫu cay.
Chiều cao chồi trung bình (cm) ( tinh từ mặt thạch lên chop lá cao nhất) = tổng chiều cao chéi/ tổng số mẫu cấy.
3.3.2. Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của các liều chiếu xạ đến biến đổi hình thái 3.3.2.1. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của các liều chiếu xạ đến biến đổi hình thái trong quá trình sinh trưởng của chdi.
Mục tiêu: xác định sự biến đổi hình thái của các chéi phát triển từ các liều chiếu xạ
khác nhau.
Cách tiến hành: chọn các chồi sống sạch, khoẻ mạnh sau quá trình nhân nhanh chồi dé làm vật liệu cho thí nghiệm 2. Cay mẫu vào mỗi trường MS cơ bản chứa 30 g/l saccharose, 8 g/ agar và chiếu xạ mẫu ở các liều chiếu xạ khác nhau như bảng 3.1. Sau đó chuyên các mẫu vào môi trường MS có bồ sung 3 mg/1 BA.
Bồ trí thí nghiệm: theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố với 4 nghiệm thức, 3 lần lặp lại. Mỗi nghiệm thức được cấy 9 mẫu, 3 mẫu cấy vào 1 bình môi trường MS cơ bản chứa 30 g/1 saccharose, 8 g/ agar b6 sung 3mg/1 BA. Tổng số mẫu là 108 mẫu.
Bảng 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của các liều chiếu xạ đến biến đổi hình thái trong sinh
trưởng choi.
Nghiệm thức Liều chiếu xạ Số mẫu/NT Tổng số mau/NT (3 lần lặp lai)
NT1 0 9 Ai N12 10 9 2]
NT3 20 9 27 NT4 40 9 27
Chỉ tiêu theo dõi sau 30 ngày nuôi cấy :
Chiều cao chồi trung bình (cm) (tính từ mặt thạch lên chóp lá cao nhất) = tổng chiều cao của chéi/ tổng số mau cay
Số lá trung bình/chồi (chồi) = tông số lá trên chồi/ tổng số mẫu cay Đặc điểm hình thái: hình dang, kích thước, màu sắc, sức sống.
3.3.2.2. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của các liều chiếu xạ trong quá trình hình thành rễ
Mục tiêu: xác định sự ảnh hưởng trong quá trình sinh trưởng rễ ở các liều chiếu xạ
khác nhau.
Cách tiến hành: chọn các chỗồi sống sạch, khỏe mạnh ở thí nghiệm 2 với các nghiệm thức chiếu xạ khác nhau chuyền vào môi trường MS cơ bản chứa 30 g/1 saccharose, 7 g/
agar có bổ sung 0,5 mg/l NAA.
Bồ trí thí nghiệm: với 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được cay 9 mau, 3 mau được cấy vào 1 bình môi trường cơ ban chứa 30 g/l saccharose, 8 g/ agar có bổ sung 0,5 mg/l NAA. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Tổng số mẫu là 108 mau.
Bảng 3.3. Khảo sát ảnh hưởng của các liều chiếu xạ trong giai đoạn hình thành rễ
Nghiệm thức Liều chiếu xạ S6 mau/NT Tổng số mau/NT (3 lần lặp lại)
NI 0 9 Zi NT2 10 9 ZT NI3 20 9 27 N14 40 9 27
Chi tiéu theo d6i sau 30 ngay nudi cay:
Thời gian cam ứng tạo rễ (ngày) (Tinh từ khi chuyển cây vào môi trường đến khi xuất hiện rễ)
Chiều dài trung bình rễ/cây (cm) = Tổng chiều dài ré/ Tổng số mẫu cấy (Dùng thước có chia vạch đo chiều dài của rễ dài nhất và đo từ gốc rễ đến chóp rễ).
Số ré/chéi (rễ) = Tổng số rễ/ Tổng số mẫu cấy 3.4. Xử lí số liệu
Số liệu thu được sẽ xử lý thống kê trên máy tính bằng phần mềm Minitab. Đọc kết
quả dựa vào bảng ANOVA.
19