2.1 Thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 05 đến tháng 11 năm 2022, tại trường ĐH Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh và xã Long Khê, huyện Cần Đước, tinh Long An.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập nam gay bénh trén cay rau ho thap tu va xac dinh mot số đặc điểm
hình thai của nâm Rhizoctonia solani.
- Đánh giá tính gây bệnh của nam R. solani trên một số loại cải trong điều kiện
phòng thí nghiệm.
- Đánh giá khả năng đối kháng với nam R. solani của một số dong xạ khuẩn trong điều kiện phòng thí nghiệm.
- Đánh giá khả năng phòng trừ với nam R. solani của dong xạ khuẩn trong điều kiện
nhà lưới.
- Đánh giá khả năng trừ bệnh với nam R. Solani của dòng xạ khuẩn ở điều kiện ngoài đồng.
2.3 Vật liệu nghiên cứu
2.3.1. Nguồn nắm R. solani:
Phương pháp thu mẫu: Tiến hành thu thập các mẫu bệnh có triệu chứng điển hình do nam R. solani gây hại trên cây trồng họ thập tự tại tỉnh Bình Dương. Các mẫu bệnh được bảo quản trong hộp nhựa, sau khi thu thập, mẫu bệnh được mang về phòng thí nghiệm và phân lập tác nhân theo phương pháp của Burgess và cs, (2009). Các mẫu được bảo quản theo phương pháp quản lý thực vật của Shivas và Beasley, (2005). Mẫu bệnh được mã hóa theo cây ký chủ va địa điểm thu mẫu (Bang 2.1).
Bang 2.1. Danh sách mau nam bệnh phân lập từ các mẫu bệnh thu thập
: Vị trí bị : : s
STT Cây trông Địa điểm thu mau Mã hóa mau bệnh bệnh
1 Cai ngot Cô rễ Bình Dương CN-BD 2 — Cảingồng Cổ rễ Bình Dương CG-BD 3 Cải xanh Cô rễ Bình Dương CX-BD
Phương pháp phân lập: Các mẫu bệnh có triệu chứng bệnh điển hình được quan sát và chọn cân thận, sau đó rửa đưới vòi nước dé loại bỏ các tạp chat và bụi ban. Dùng dao đã khử trùng bằng đèn cồn cắt mẫu bệnh thành từng miếng nhỏ (1 — 2 mm) tại phần tiếp giáp giữa mô khỏe và mô bệnh. Mẫu bệnh được khử trùng bề mặt bằng cồn 70°
trong vòng 30 giây, rửa qua bằng nước cat vô trùng 3 lần và sau đó thắm khô mẫu bệnh bằng giấy thấm vô trùng. Dùng kẹp đã khử trùng cấy các mẫu bệnh vào môi trường WA.
Các đĩa được dé ở nhiệt độ 27 + 2°C và quan sát mỗi ngày. Khi tản nam phát triển (1 — 2 cm) trên môi trường WA quan sát sợi nam của tản nam có đặc điểm hình thái đặc trưng của nam bệnh tiến hành tách và làm thuần nắm bệnh trên môi trường PGA.
Định danh loài nam R. solani: dựa vào các đặc điểm về hình thái như màu sắc, đặc điểm tan nam, đặc điểm sợi nam, hình dang và màu sắc hạch nam dựa theo khóa phân
loại của Ogoshi (1975); Sneh (1991); Zheng (2011).
- Phương pháp định danh nam R. solani theo màu sắc, đặc điểm phát triển tản nam, hạch nam: tat cả các mẫu phân lập (MPL) được nuôi cấy trên môi trường MEA trong điều kiện 12 giờ sáng — 12 giờ tối, sau 7 ngày nuôi cấy ghi nhận các đặc điểm về tan nam và hạch nam.
- Phương pháp định danh nam R. solani theo đặc điểm sợi nam: Tat cả các MPL nuôi cấy trên môi trường MEA trong điều kiện 12 giờ sáng — 12 giờ tối, sau 3 ngày nuôi cấy tién hành làm tiêu bản dé quan sát đặc điểm sợi nắm dưới kính hiển vi có độ phóng
đại 40X.
2.3.2. Các vật liệu nghiên cứu khác
- Nguồn xạ khuẩn: đo Phòng Sinh học ứng dụng thực vật, Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phó Hồ Chi Minh cung cấp (5 dòng xạ khuẩn).
- Trang thiết bị: Tủ cấy khử trùng, máy hấp khử trùng bằng hơi nước nóng (121°C trong 20 phút), tủ sấy khử trùng (180°C), kính hiển vi quang học Olympus CX31, cân
điện tử, bếp điện, lò viba, dia petri (loại thủy tinh 90 x 15 mm), kẹp, dao cay, đèn cồn
150 mL, giấy báo, cốc thủy tinh (250 mL, 500 mL), ...
- Các môi trường dinh dưỡng: Môi trường Môi trường PDA (20 gram Dextrose,
20 gram Agar và 200 gram khoai tây, nước cất vừa đủ 1000 ml); Môi trường MEA (20 gram Malt extract (mach nha), 20 gram Agar, nước cất vừa đủ 1000 ml); Môi trường WA (nước cất 1000ml, 20 gram Agar); Môi trường Gause I (20 gram tinh bột tan; 0,5
gram MgSO4.7H20; 0,5 gram K2HPO4; 1 gram KNO3; 0,5 gram NaCl; 0,01 gram
FeSO4.7H2O; 20 gram agar, nước cất 1000 ml).
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Đánh giá tinh gây bệnh của các MPL nam R. solani trên một số loại cải trong điều kiện phòng thí nghiệm
Thí nghiệm tiến hành đánh giá trên 3 loại cải ngọt, cải ngồng và cải xanh được thực hiện trong đĩa pétri (90 x 15 mm) theo phương pháp của Keijer và cs (1997). Ba mẫu phân lập (MPL) R. solani đại diện cho 2 nhóm nam (nhóm có hạch và nhóm không hạch) được sử dụng dé đánh giá. Môi trường đề thực hiện thí nghiệm là WA, 12 hạt giống của mỗi loại rau được ủ nứt mầm và đặt trên một đường thang với khoảng cách bằng nhau trên bề mặt thạch.
Hai khoanh tản nam (đường kính 4 mm) được đặt giữa các hạt giống, khoanh môi trường WA được sử dụng đối chứng, 3 lần lặp lại. Dùng giấy bạc bọc một nửa đĩa pétri để ngăn ánh sáng chiêu vào rễ và đặt nghiêng một góc 60°. Các đĩa pétri được dé trong phòng thí nghiệm, nhiệt độ 28 + 2°C, 12 giờ sáng, 12 giờ tối.
Theo dõi hàng ngày ghi nhận thời gian xuất hiện vết bệnh (ngày), tỉ lệ bệnh (%) được đánh giá 1 lần tại thời điểm 5 ngày sau chủng bệnh theo công thức: TLB (%) = A/B x 100%. Trong đó: A là số cây bị bệnh; B là tổng số cây theo dõi.
Cấp bệnh (chỉ số bệnh) là đại lượng đặc trưng cho mức độ bị hại của cây trồng được chia thành 5 cấp theo Carling và cs, (1999): Cấp 0: không có triệu chứng bệnh - không gay bệnh; Cấp 1: Trụ hạ diệp hơi mất màu — gây bệnh nhẹ; Cấp 2: Trụ hạ diệp mất màu và các vết bệnh nhỏ (đường kính <Imm) trên thân, trụ hạ diệp, lá hoặc rễ - gây bệnh nhẹ; Cấp 3: Trụ hạ điệp mat màu và các vết bệnh lớn (đường kính >Imm) trên thân, trụ hạ diệp, lá hoặc rễ - gây bệnh nặng; Cấp 4: Cây con chết — gây bệnh nặng.
Bảng 2.2. Các loại rau được sử dụng trong thí nghiệm
STT Cây trồng Tên khoa học
1 Cải bẹ xanh Brassica juncea 2 Cai ngot Brassica integrifolia
3 Cải ngồng Brassica chinensis var. parachinensis
2.4.2. Đánh giá khả năng đối kháng R. solani của một số dòng xạ khuẩn trong điều kiện
phòng thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tô gồm 6 nghiệm thức, tương ứng với 5 dong xạ khuẩn và 1 đối chứng (nấm R. solani được nuôi trong đĩa pétri chứa môi trường PDA không xạ khuẩn), mỗi nghiệm thức 03 đĩa pétri, 3 lần lặp lại.
Chuẩn bị nguôn xạ khuẩn và nam: xạ khuân và nam được nuôi cấy trên môi trường PDA 7 ngày sau đó tiến hành thí nghiệm theo phương pháp cấy kép. Xa khuan được cấy thành hai đường thang song song bằng que cấy vòng trên đĩa pétri chứa 10 ml môi trường PDA. Sử dụng dụng cụ đục lỗ đường kính 4 mm lấy khoanh nam chuyển vào giữa đĩa pétri đã cấy xạ khuẩn. Đĩa pétri được đặt trong điều kiện nhiệt độ phòng và đánh giá khả năng đối kháng của các dong xạ khuẩn với nam R. solani bằng cách đo đường kính tản nam và tính hiệu suất đối kháng ở thời điểm 24, 48 và 72 giờ sau thí nghiệm. Hiệu suất đối kháng (HSDK) được tính toán theo Palanayandi và cs, (2011): Hiệu suất đối kháng (%)=((G1- G2)/G1) x 100%. Trong đó: G1 là đường kính vùng tản nắm ở nghiệm thức đối chứng ; G2 là đường kính vùng tan nam ở nghiệm thức có xạ khuẩn.
Bảng 2.3. Đặc điểm của 5 dòng xạ khuẩn thực hiện khảo sát khả năng đối kháng STT Ký hiệu Đặc điểm hình thái Hình ảnh
Khuẩn lạc màu trắng xám và có hình
| BT02 dạng phóng xạ. Khuan ty cơ chất có màu tím hoặc trắng
Khuan lạc mau trắng xám. Khuan ty co
2 BT03 oe ớt by
chat có mau nâu vang.
Khuan lạc có mau trang, tron, dang 3 BT07 phóng xa. Khuẩn ty cơ chất có mau
trắng ngà.
Khuan lạc màu trang xám, tâm lôi rõ, 4 BT09 — mép dang rang cưa và có viên mau
xám. Khuan ty cơ chat màu nâu vàng.
Khuẩn lạc có màu trắng, tròn, dạng 5 BT16 phóng xạ. Khuẩn ty cơ chất có màu
trắng ngà.
2.4.3. Định danh dựa trên phan tích trình tự gen 16S rRNA
Dòng xạ khuẩn có hiệu suất đối kháng cao nhất được nuôi cấy trên môi trường R2YE lỏng, sau 72 giờ ly tâm ở 4000 rpm trong 10 phút, ở 4°C, thu tế bào. DNA tổng số của xạ khuẩn được tách theo phương pháp của Sambrook và Rusell (2001), đoạn gen 16S rRNA được khuếch dai bằng phương pháp PCR sử dụng cặp primer 27F 5’-
AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’ và 1492R 5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT- 3’ (Genset). Phản ứng được thực hiện theo chu trình nhiệt được trình bay
Bảng 2.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR
Giai đoạn Nhiệt độ (°C) Thời gian Số chu kỳ Tiền biến tính 94 5 phút 1
Bién tinh 94 30 giây 35 Bat cap 55 30 giây 35
Kéo dai 72 60 giây 35 Hau kéo dai 72 10 phút |
Sản phâm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel
agarose 1%. Kích thước của đoạn DNA thu được sau phản ứng PCR được so sánh với
thang DNA chuan (1 Kb Plus DNA ladder Marker). Sản phẩm PCR được tinh sạch, giải
trình tự và so sánh trình tự gen tương ứng trên co sở dữ liệu Genbank nhờ công cu BLAST (www.ncbi.nih.gov).
2.4.4. Đánh giá kha năng phòng trừ nam #. solani của xa khuẩn trong điều kiện nha lưới 2.4.4.1. Đánh giá khả năng phòng bệnh do nam R. solani của xạ khuẩn
Phương pháp bố trí thí nghiệm: Từ kết quả đánh giá khả năng đối kháng của xạ khuẩn đối với nam R. solani trong điều kiện phòng thí nghiệm (2.4.2). Chọn 1 dong xạ khuẩn có khả năng đối khang cao nhất dé thực hiện thí nghiệm đánh giá khả năng phòng bệnh trong điều kiện nhà lưới. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tô với 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức thực hiện 2 khay, mỗi khay 50 hạt cải xanh, 4 lần lặp lại. Thí nghiệm được thực hiện 2 lần độc lập.
Các nghiệm thức như sau:
Nghiệm thức 1: hạt không xử lý gieo đất sạch (đói chứng âm).
Nghiệm thức 2: hạt không xử lý gieo đất nhiễm nam bệnh (đối chứng đương).
Nghiệm thức 3: hạt xử lý xạ khuân gieo đất nhiễm nắm bệnh.
Nghiệm thức 4: hạt xử lý thuốc trừ bệnh Dithane M45 WP (80% Mancozeb).
Phương pháp thực hiện
Khay hình chữ nhật (68 x 42 x 15 cm) chứa 5 kg giá thé hỗn hợp đất — tro trâu — xơ dừa được trộn theo tỉ lệ 1 — 1 — 1, khử trùng bằng hơi nước nóng 121°C trong 20 phút.
Chung 500 hạch nam ở mỗi khay nhựa (theo từng nghiệm thức) ở độ sâu 1 — 5 cm. Các khay được bao phủ bằng màng nhựa và ủ trong 7 ngày ở nhiệt độ phòng đề thúc đầy sự phát triển của mầm bệnh.
Chuẩn bị xạ khuẩn: xạ khuẩn được nuôi nhân trong đĩa pétri chứa môi trường Gause I. Sau 7 ngày, tiền hành bơm 5 ml nước cat thanh trùng vào dia, dùng lam (đã thanh trùng) thu sinh khối, và lọc qua vải lược đã thanh trùng thu được sinh khối xạ khuẩn. Pha loãng điều chỉnh mật số 107 cfu/m.
Nghiệm thức hạt không xử lý: Hạt cải xanh được khử trùng bề mặt, sau đó được làm khô, gieo với độ sâu 1 em vào khay đất theo từng nghiệm thức đối chứng âm, đối
chứng dương.
Nghiệm thức hạt xử lý xạ khuẩn: Hạt cải xanh được khử trùng bề mặt ngâm 30 phút trong huyền phù xạ khuẩn mật số 10” CFU/ml, sau đó được làm ráo và gieo với độ
sâu 1 cm vào đất đã chủng nam.
Nghiệm thức hạt xử lý thuốc chứa hoạt chất mancozeb: Hạt cải xanh được khử trùng bề mặt ngâm 30 phút trong mancozeb với nồng độ 4,167 mg/ml và sau đó được làm ráo gieo với độ sâu 1 cm vào đất đã chủng nắm.
Chỉ tiêu theo dõi
- Đếm số cây bị bệnh bao gồm các triệu chứng: héo, lá rũ, lở cô rễ, chết rạp ở thời điểm 10 ngày sau khi gieo hạt. Tỉ lệ bệnh tính theo công thức: TLB (%) = A/B x 100%.
Trong đó: A là số cây bị bệnh; B là tổng số cây điều tra.
- Khả năng phòng bệnh tính theo công thức (Susilowati va cs, 2011): Khả năng
phòng bệnh (%) = [(C* - C/(C - C*)] x 100; Trong đó: C* là số cây khỏe mạnh trong nghiệm thức; C là số cây khỏe mạnh trong đối chứng nhiễm bệnh; C- là số cây khỏe mạnh trong đối chứng không bị nhiễm bệnh.
- Các chỉ tiêu về sinh trưởng: Chiều cao cây (cm) do từ bề mặt giá thé đến chóp lá cao nhất của cây; Chiều dài rễ (cm) đo từ cô rễ đến đỉnh sinh trưởng của chop rễ dài nhất.
- Trọng lượng tươi và trọng lượng khô: Trọng lượng tươi (mg/cây): xác định bằng cách cân khối lượng cây tươi. Trọng lượng khô (mg/cây): xác định bằng cách cân sau khi say ở nhiệt độ 50°C cho đến khi khối lượng không đổi.
2.4.4.2. Đánh giá khả năng trừ bệnh do nam R. solani của xạ khuẩn
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tô với 3 nghiệm thức (1 nghiệm thức xử lý xa khuẩn, 1 nghiệm thức xử lý thuốc chứa hoạt chất mancozeb, 1 đối chứng phun nước), mỗi nghiệm thức thực hiện 2 khay, mỗi khay trồng 15 cây cải xanh, 4 lần lặp lại. Thí nghiệm được thực hiện 2 lần độc lập.
Mỗi khay chứa 5 kg giá thé đã được hap khử trùng, tiến hành chủng 500 hạch nam R. solani ở mỗi khay nhựa ở độ sâu 1 — 5 cm. Các khay được bao phủ bằng màng nhựa và ủ trong 7 ngày ở nhiệt độ phòng đề thúc đây sự phát triển của mầm bệnh. Hạt cải xanh được khử trùng bề mặt bằng cách rửa với Ethanol 70% trong 30 giây, tiếp theo ngâm trong dung dịch Sodium hypochlorite (NaOCl) 1% trong 5 phút. Sau đó hạt giống được rửa lại 3 lần với nước cất vô trùng, sau đó được làm khô, gieo với độ sâu 1 cm vào bầu đất đã khử trùng. Tiến hành trồng cây cải xanh 15-20 ngày tuổi (3-4 lá thật) vào khay nhựa đã được chủng nam R. solani.
Thời điểm xử ly: 1 lần, khi cải xanh đang có bệnh lở cô rễ bắt đầu gây hai với ti
lệ bệnh khoảng 5%.
Chỉ tiêu theo dõi
Đếm số cây bị bệnh bao gồm các triệu chứng: héo, lá rũ, lở cổ rễ, chết Tạp ở các thời điểm 3, 7 và 14 ngày sau khi phun xử lý và tính theo công thức:
- Ti lệ bệnh tinh theo công thức: TLB (%) = A/B x 100%. Trong đó: A là số cây bị bệnh; B là tổng số cây điều tra.
- Hiệu lực phòng trừ tính theo công thức Henderson - Tilton:
E(%) = {1-[(Ta x Cb)/(Tb x Ca)]} x 100
Trong đó: E: Hiệu luc phòng trừ; Ta: Ti lệ bệnh mới phát sinh ở công thức xử ly
thuốc tại thời điểm sau xử lý; Tb: Tỉ lệ bệnh công thức xử lý thuốc tại thời điểm trước xử lý; Ca: Tỉ lệ bệnh mới phát sinh ở công thức đối chứng tại thời điểm sau xử lý; Cb: Tỉ lệ bệnh ở công thức đối chứng tại thời điểm trước xử lý.
- Diện tích bên dưới đường cong tích lũy bệnh AUDPC (Area Under Disease Progressive Curve) được tính theo công thức (Cooke, 2006):
AUDPC=}j.:[Œi + Yù + 1)/2]x (Tj + 1— Tj)
Trong đó: n tổng số ngày theo dõi, i ngày theo dõi thứ ¡, Y; tỉ lệ bệnh ngày thứ ¡, Yin Tỉ lệ bệnh ngày thứ i+1, Tj — Tj thời gian giữa 2 lần theo dõi.
- Các chỉ tiêu về sinh trưởng: Chiều cao cây (cm); Số lá/cây; Chiều dai lá (cm);
Chiều rộng lá (cm); Chiều dài rễ (cm).
- Chỉ tiêu về năng suất: Trọng lượng tuoi (g/cây), trọng lượng 6 thí nghiệm (g).
2.4.5. Đánh giá khả năng trừ bệnh lở cỗ rễ của xạ khuẩn ngoài đồng
Thí nghiệm được bồ trí theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 3 nghiệm thức, 4 lần lặp lại, trong đó 1 nghiệm thức xử lý xạ khuẩn với mật số 107 cfu/ml, 1 nghiệm thức xử lý thuốc chứa hoạt chất mancozeb, 1 nghiệm thức đối chứng (phun nước).
- Quy mô thí nghiệm: Mỗi 6 thí nghiệm: 16 m?; Tổng diện tích thí nghiệm: 16 m2 x3x4= 192m?
- Chuẩn bị đất: Cày bừa, xới xáo kỹ đất trồng, phơi ải đất 5-7 ngày. Dọn sạch cỏ dại và các xác thực vật từ vụ trước; làm đất kỹ, tơi nhỏ, lên luéng cao 20 — 25 cm, mat luống rộng 1,6 m, dai 10 m, san đều mặt phang luống.
- Chuan bi cây con: Hat cải xanh được khử trùng bề mặt, sau đó được làm khô và gieo vào đất. Tién hành trồng cây cải xanh 16 ngày tuổi (3-4 lá thật) vào luống với khoảng
cách cây x cây 10 cm, hang x hang 15 cm.
Chăm sóc cây: Tưới nước ngày 2 lần vào buổi sáng sớm và chiều mat. Bon phân khi cây có 2 lá thật (8 — 9 NSG) tiến hành tưới phân hữu cơ, 7-10 ngày tưới 1 lần. Phòng trừ sâu sử dụng thuốc trừ sâu có nguồn gốc vi sinh.
- Chuẩn bị xạ khuẩn: Các dòng xạ khuẩn được nuôi nhân mật số trong đĩa pétri chứa môi trường Gause I. Sau 7 ngày, tiến hành bơm 5 ml nước cất đã được thanh trùng vào đĩa, dùng lam (đã thanh trùng) thu sinh khối, và lọc qua vải lược đã thanh trùng thu được sinh khối xạ khuẩn. Tiến hành pha loãng điều chỉnh mật số 107 cfu/ml.
-Thời điểm xử lý: 1 lần, khi cải xanh đang có bệnh lở cô rễ bắt đầu gây hại với tỉ
lệ bệnh khoảng 5%.
- Phương pháp điều tra:
+ Theo dõi tỉ lệ bệnh: Mỗi ô thí nghiệm điều tra 5 điểm theo đường chéo góc, mỗi điểm theo dõi 30 cây.