2.1 Nội dung nghiên cứu
Phân lập nắm gây bệnh nứt thân xì mủ trên cây sầu riêng.
Định danh nam gây bệnh nứt thân xì mủ trên cây sầu riêng bằng đặc điểm hình
thái.
Đánh giá khả năng ức chế của các vật liệu nano đến sự phát triển của tản nam.
2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
2.2.1 Thời gian nghiên cứu
Đề tài được tiến hành từ tháng 05 năm 2021 đến tháng 11 năm 2022.
2.2.2 Địa điểm nghiên cứu.
Được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bệnh cây của Bộ môn Bảo vệ Thực vật -
khoa Nông học, trường Đại học Nông Lâm thành phó Hồ Chí Minh.
2.2.3 Nguồn mẫu
Mẫu bệnh được thu thập tại xã Cam Son, huyén Cai Lay, tinh Tién Giang.
2.3 Vật liệu và dung cụ thí nghiệm
Dụng cụ thí nghiệm trong phòng: đĩa petri, lam, nước cất, ống đong, đũa cấy, đèn cồn, cồn 70°, cồn 96°, môi trường PDA, môi trường WA,. Tat cả dụng cụ va
môi trường đêu được vô trùng.
Thiết bị thí nghiệm trong phòng: Tủ cấy khử trùng, tủ sấy khử trùng (180°C), nồi hấp khử trùng bằng hoi nước nóng (121°C), cân điện tử, lò viba, kính hién vi
quang hoc Olympus CX31.
16
Các vật liệu nano AgCuSi02, CuNPs-cts 1%, CuSi02-cts 1%, CuNPs-cts 0,4%,
CuSiO>-cts 0,4% được cung cấp bởi Green lab trường Đại học Khoa học Tự nhiên.
2.4 Phương pháp thí nghiệm
Phân lập nắm gây bệnh nứt thân xì mủ trên cây sầu riêng.
2.4.1 Phương pháp thu thập mẫu
Quan sát và chọn những cây sầu riêng đã có biểu hiện của triệu chứng bệnh nứt thân xì mủ. Phần thân cây chảy nhựa trên bề mặt vỏ thân, vết bệnh ướt và nhựa có màu nâu. Vỏ thân và gỗ bên dưới bị chuyên sang màu hồng nhạt có bớt tím, viền gon sóng, bệnh lan dần vào bó mạch. Khi cạo lớp vỏ bị bệnh ra thấy phần gỗ có màu nâu sam
dọc theo thân, cành.
Lấy mẫu thân bao gồm cả mô bệnh và mô khỏe. Mẫu được thu và cho vào túi nilon và ghi thông tin người lay mẫu, ngày lấy mau, tên cây ky chủ, địa chỉ nơi lấy mẫu, tên mẫu bệnh, triệu chứng và dấu hiệu của cây bị bệnh.
2.4.2 Quá trình thu thập mẫu bệnh
Các mẫu bệnh được lấy từ thân cây có triệu chứng đặc trưng của bệnh nứt thân xì mủ tại xã Câm Sơn, huyện Cây Lậy, tỉnh Tiền Giang.
Triệu chứng cây bị bệnh nứt thân xi mủ: Trên thân và cành cây có các vét nứt ngắn hoặc dài, ở vết nứt này có nhựa chảy ra, vết bệnh ướt và nhựa có màu nâu. Vỏ thân và gỗ bên dưới bị chuyên sang màu hồng nhạt, có bớt tím, viền gợn sóng, bệnh lan dần vào bó mạch. Khi cạo lớp vỏ bị bệnh ra lấy phần g6 có màu nâu sam dọc theo
thân, cành.
Hình 3.1 Triệu chứng bệnh nứt thân xì mủ trên cây sầu riêng A: Thân cây bị bệnh; B: Vết bệnh chảy nhựa
2.4.3 Phương pháp phân lập nắm từ mẫu bệnh
Phương pháp chuẩn bị một số môi trường cho quá trình phân lập
Môi trường WA (môi trường Water Agar): Dun sôi 500 ml nước cat, sau đó thêm vào 20 g agar nấu cho đến khi tan hết agar và thêm nước cất vào cho đến khi dung dịch vừa đủ 1000 ml. Hap khử trùng bằng nồi hap ở nhiệt độ 121°C, 1 atm trong 20 phút sau đó đồ ra dia petri (mỗi đĩa 15 ml dung dich).
Môi trường PDA (môi trường Potato Dextrose Agar): 20 g khoai tay đã lột vỏ,
rửa sạch, thái nhỏ, nấu trong 500 ml nước cất cho đến khi khoai tây mềm, lọc bỏ bã, thêm 20 g agar vào nấu cho đến khi hoà tan hoàn toàn, thêm nước cất vào cho đến khi dung dịch vừa đủ 1000 ml. Hap khử trùng bằng nồi hap ở nhiệt độ 121°C, 1 atm trong 20 phút sau đó đồ ra đĩa petri (mỗi đĩa 15 ml dung dịch).
Phương pháp phân lập nắm từ thân
Áp dụng phương pháp của Burgess và ctv (2009) cho việc phân lập nấm từ thân
được thực hiện như sau:
Tiến hành phân lập trên môi trường WA và PDA.
Phương pháp phân lập: Rửa sạch mẫu thân dưới vòi nước để loại bỏ đất và các vi sinh vật hoại sinh bám ở ngoai thân. Cắt thân thành những đoạn dai 2 cm tai phần ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe. Khử trùng mẫu bằng ethanol 70% trong 1 phút sau đó rửa bằng nước cat vô trùng 4 lần rồi thấm khô bằng giấy thấm vô trùng. Cay mẫu lên môi trường WA, sau khi cấy xong nên đặt ngược dia petri dé tránh đọng hơi nước trên bề mặt môi trường cấy, tiếp đến đặt đĩa petri trong điều kiện nhiệt độ phòng
18
(25°C - 28°C). Khi các sợi nam bat đầu xuất hiện từ các mẫu cấy tiến hành cấy chuyền đỉnh sợi nam lên môi trường PDA. Làm thuần mẫu nam bằng cách tiếp tục cấy đỉnh
sinh trưởng của sợi nâm.
2.4.4 Quá trình phân lập
Quá trình thu mẫu được tiến hành tại 4 vườn trồng sau riêng, tổng số mẫu bệnh thu được gồm 12 mẫu. Trong đó mỗi vườn thu trên 3 cây, mỗi cây tiến hành thu 1 mẫu bệnh trên thân, cành. Thu thập và bảo quản mẫu theo phương pháp quản lí mẫu bệnh thực vật của Roger và ctv (2005) sau đó chuyên về phòng thí nghiệm dé tiến hành
phân lập.
Hinh 3.2 Mau bénh thu thap duoc Quá trình phan lập mẫu được tiến hành theo cách bước:
Cắt mẫu
Rửa và khử trùng mẫu
Tham khô mẫu
1
Đặt các mẫu bệnh lên môi
trường WA
Các mẫu bệnh sau khi được tiến hành phân lập và tách thuần trên môi trường PDA cho kết quả như sau:
Hình 3.3 Kết quả phân lập được từ mẫu bệnh
Hình thai nam Phytophthora sp. phân lập được từ mâu bệnh ở thân
2.4.5 Phương pháp lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch
Áp dụng phương pháp theo Burgess và ctv (2009) tiến hành lây bệnh nhân tạo.
Được thực hiện trên cây sầu riêng 1 năm tuổi, tiễn hành tạo viết thương hở sau đó cắt thạch nam gắn lên vết thương đã tạo ở trước đó.
2.4.6 Định danh nắm gây bệnh nứt thân xì mủ trên cây sầu riêng bằng đặc điểm
hình thái.
Nhận diện sơ bộ các dòng nam đã được phân lập thông qua đặc điểm hình thái Sau khi phân lập, các mẫu nam được quan sát bằng mắt thường và kính hiển vi (Klich, 2002) về hình dạng tan nam, màu sắc bào tử, đặc điểm cơ quan sinh bào tử, hình dang bao tử dé tiến hành nhận diện sơ bộ.
2.4.7 Đánh giá hiệu lực phòng trừ của một số vật liệu nano đối với nắm gây bệnh thối rễ trên cây sầu riêng trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Tìm ra nồng độ nano AgCuSiO2, CuNPs-cts 1%, CuS1O¿-cts 1%, CuNPs-cts 0,4%, CuSiO2-cts 0,4% có khả năng chế sự phát triển của nắm cao nhất.
Phương pháp thí nghiệm
20
Thí nghiệm đơn yếu tố được bồ trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi nồng độ (16, 32, 64, 125, 250 ppm) là một nghiệm thức và 1 nghiệm thức đối chứng (không ding thuốc) được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại 3 đĩa petri.
Bảng 2.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá hiệu lực phòng trừ của vật liệu nano CuNP:-cts 1%
Nghiệm thức Nano Hoạt chất Nông độ (ppm)
NHI Cu CuNP›s-cts 1% 16 NT2 Cu CuNP.-cts 1% 32 NT3 Cu CuNP.-cts 1% 64 NT4 Cu CuNP;-cts 1% 125 NT5 Cu CuNP.-cts 1% 250
NT6 - Đối chứng (không : dùng thuốc)
Bảng 2.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá hiệu lực phòng trừ của vật liệu nano CưNP:-cts 0,4%
Nghiệm thức Nano Hoạt chất Nông độ (ppm)
NT1 Cu CuNP:-cts 0,4% 16 NT2 Cu CuNP:-cts 0,4% 32 NT3 Cu CuNP.-cts 0,4% 64 NT4 Cu CuNP:-cts 0,4% 125 NT5 Cu CuNP:-cts 0,4% 250
NT6 a Đối chứng (không : dùng thuốc)
Bang 2.3 Thí nghiệm 3: Đánh giá hiệu lực phòng trừ của vật liệu nano CuSiO2-Cts 1%
Nghiệm thức Nano Hoạt chất Nông độ (ppm)
NT1 Cu CuSiO2-cts 1% 16 NT2 Cu CuS1Oz-cts 1% 32 NT3 Cu CuS10>2-cts 1% 64 NT4 Cu CuSiO2-cts 1% 125 NT5 Cu CuSi02-cts 1% 250
NT6 - Đối chứng (không ˆ dùng thuốc)
Bảng 2.4 Thí nghiệm 4: Đánh giá hiệu lực phòng trừ của vật liệu nano CuSiO2-Cts 0,4%
Nghiệm thức Nano Hoạt chất Nong độ (ppm)
NT1 Cu CuSi0>2-cts 0,4% 16 NT2 Cu CuSiO2-cts 0,4% 32 NT3 Cu CuSiO2-cts 0,4% 64 NT4 Cu CuSi0>2-cts 0,4% 125 NTS Cu CuSiO>2-cts 0,4% 250
NT6 - Đối chứng (không - dùng thuốc)
De
Bảng 2.5 Thí nghiệm 5: Đánh giá hiệu lực phòng trừ của vật liệu nano AgCuSiO2
Nghiệm thức Nano Hoạt chất Nông độ (ppm)
NT1 Cu AgCuSiO2 16 NT2 Cu AgCuSiO; 32 N13 Cu AgCuSiO› 64 N14 Cu AgCuSiO; 125 NTS Cu AgCuSiO 250
NT6 - Đối chứng (không - dùng thuốc)
Phương pháp tiến hành:
Chuẩn bị môi trường PDA được hap khử trùng trong nồi hap (121°C), sau đó dé nhiệt độ giảm xuống khoàng 45 - 50°C rồi pha với thuốc theo nồng độ quy định sẵn, lắc đều rồi đồ môi trường ra dia petri (ghi kí hiệu loại thuốc, nghiệm thức, lần lặp lại và ngày tiến hành thí nghiệm ở nắp đậy đĩa petri, mặt dưới đĩa petri kẻ hai đường vuông góc đi qua tâm đĩa). Cây khoanh nam (đường kính 0,5 cm) vào trung tâm đĩa petri, mặt nam úp xuống mặt môi trường PDA, dán kín xung quanh đĩa môi trường bang paraffin.
Chỉ tiêu theo đõi
Đường kính trung bình tan nam: Đường kính tan nam (tan sợi) (mm) ở một ngày NSC đo lấy chỉ tiêu đầu tiên, các lần đo sau cách nhau 24 giờ. Tiến hành đo cho đến khi tan nam (tan sợi) phát triển chạm vào thành dia ở nghiệm thức đối chứng thi
ngưng quá trình đo.
Đường kính trung bình của tản nấm (tản sợi) được tính bằng công thức:
d=(d1+d2/2.
Trong đó: d là đường kính trung bình tản nắm (tan soi); d1, d2 là chiều dài hai
đường chéo của tản nam (tan soi)
Hiệu lực hoạt chất thuốc (%) được tính bằng công thức:
H = [(D-d)/D]x100
Trong do: H: 1a hiéu luc hoat chất thuốc; D: là đường kính tản nam của nghiệm thức đối chứng (mm); d: là đường kính tản nam của nghiệm thức chứa hoạt chất thuốc (mm).
2.4.2 Xứ lý số liệu
Các số liệu thu thập được tính toán bằng phần mềm Microsoft Excel 2010.
Phân tích ANOVA và trắc nghiệm phân hang bằng phần mềm SAS 9.1
24
Chương 3