NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.3 Khảo sát khả năng đối kháng của các vi sinh vật với nam gay bệnh lở cỗ rễ
trên cây cà chua trong điều kiện nhà lưới
Từ kết quả đánh giá khả năng đối kháng của các vi sinh vật trong điều kiện phòng thí nghiệm đối với nam gây bệnh lở cô rễ, 2 dòng vi sinh vật CC — LD 2.4 và O — BT 1.2 được chọn là không có độc tính và có hiệu suất đối kháng cao nhất dé thực hiện thí nghiệm đánh giá khả năng đối kháng trong điều kiện nhà lưới.
Cây trồng được chọn đề đánh giá khả năng đối kháng là cây cà chua giống Rita.
Thí nghiệm được tiễn hành trong chậu (12 x 11 em) với giá thé là hỗn hợp đất - tro trau
— xo dừa — phân bò theo tỷ lệ I— I— 1 — 1.
Hỗn hợp dat được hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121°C trong 20 phút trước khi sử dụng. Thí nghiệm được bồ trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi 6 cơ sở là 1 nghiệm
thức.
Phương pháp thực hiện
Mỗi nghiệm thức gồm 10 chậu (12 x 11 cm), mỗi chậu trồng 2 cây cà chua cách đều nhau. VSV đối kháng được lắc ở nhiệt độ 25 + 2°C cho tới khi mật số đạt 108 CFU/ml, phun dung dịch chứa VSV ướt đều các mặt lá, thân cây và vùng đất mặt. Đĩa nam gay bệnh lở cô rễ được nuôi trong hỗn hộp vỏ trâu + hạt kê (đã được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121°C trong 20 phút trước khi sử dụng) theo tỉ lệ 1 — 1 (Burgess và ctv, 2009), sau khoảng 2 tuần nuôi cấy thì trộn hỗn hộp vao đất theo tỷ lệ 1 — 5 (hỗn hợp nắm bệnh
— đất), sau đó tiền hành chủng 20 g hỗn hợp nam gây bệnh ở trên mỗi mặt chậu.
Tiến hành thí nghiệm với 12 NT (mỗi NT gồm 10 chậu, mỗi chậu 2 cây và 3 LLL):
NT 1: Đối chứng.
NT 2: Chủng hỗn hợp nắm bệnh.
NT 3: Xử lý VSV CC — LD 2.4.
NT 4: Xử lý VSV O-BT 12.
NT 5: Xử lý VSV CC — LD 2.4, sau 24 giờ chủng hỗn hợp nắm bệnh.
NT 6: Xử lý VSV O - BT 1.2, sau 24 giờ chủng hỗn hợp nắm bệnh.
NT 7: Chung hỗn hợp nam bệnh, sau khi có dấu hiệu bệnh thì xử lý VSV CC - LÐ 2.4.
NT 8: Chung hỗn hợp nắm bệnh, sau khi có dau hiệu bệnh thì xử ly VSV O—BT 1.2.
NT 9: Xử lý VSV CC - LD 2.4 và O - BT 1.2, sau 24 giờ chủng hỗn hợp nam bệnh.
NT 10: Ching hỗn hợp nam bệnh, sau khi có dau hiệu bệnh thì xử lý VSV CC - LD 2.4
và O—BT 12.
NT 11: Xử lý VSV CC - LD 2.4, xử lý đồng thời với NT 7.
NT 12: Xử lý VSV O—BT 1.2, xử lý đồng thời với NT 8.
Chỉ tiêu theo dõi
Thời gian xuất hiện bệnh được biéu thị bằng đơn vị ngày là thời gian từ sau giai đoạn xâm nhập cho đến khi xuất hiện triệu chứng ban đầu (5 — 7%).
Tỷ lệ bệnh là sé luong cay bi hai tinh theo phan trăm (%) so với tong sé cay khao sát. Đếm số cây bị bệnh bao gồm các triệu chứng: Héo, lá rũ, lở cổ rễ, chết ở các thời điểm 7, 14 ngày.
Tỉ lệ bệnh được tính theo công thức:
TLB (%) = A/B x 100%
A: tổng số cây bị bệnh
B: tông sô cây điêu tra
Hiệu lực phòng trừ tính theo công thức:
HLPT (%) = [(D - C)/D] x 100%
D: số cây nhiễm bệnh ở nghiệm thức đối chứng
C: Số cây nhiễm bệnh ở nghiệm thức xử lý vi sinh vật đối kháng
2.4.4 Khảo sát các điều kiện tăng sinh khối của VSV có khả năng đối kháng cao 2.4.4.1 Anh hưởng của các môi trường nuôi cấy cấp 1 đến dòng CC - LD 2.4 và O
- BT 1.2
Môi trường: Nutrient — broth (NB)
Môi trường: Nutrient — broth yeast extract (NBY) Môi trường: Year extract dextrose (YDC)
Môi trường: King’B (KB)
Môi trường: Luria Broth (LB)
Mỗi ống nghiệm chứa 20 ml dung dich môi trường và được cấy 0,2 ml dung dich VSV nồng độ 108 CFU/ml, lắc 250 vòng/phút ở nhiệt độ và ánh sáng phòng. Bồ trí thi nghiệm hai yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên với yêu tố một là môi trường nuôi cấy (NB, NBY, YDC, KB, LB) và yếu tổ hai là thời gian nuôi cấy (12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ,
60 giờ, 72 gid), 3 lần lặp lại (LLL), mỗi LLL là 3 ống nghiệm.
Chỉ tiêu theo dõi
Phương pháp theo dõi bang cách do mật độ tế bào (CFU/ml) ở các thời điểm 12
giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ và 72 giờ.
Mật độ tế bào vi sinh vật được đo theo mật độ quang học với bước sóng ánh sáng là 600nm (ODứoo), mật độ quang học được do bằng mỏy Nanovue và cho biết số lượng tế bào vi sinh vật có trong dung dịch đo.
2.4.4.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến tăng sinh khối của sinh sinh vật
CC — LD 2.4 và O - BT 1.2
Khao sát nhiệt độ trong khoảng 25°C — 40°C với bước nhảy là 50C. Bồ trí thí nghiệm đơn yếu tô hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại (LLL), mỗi LLL 3 ống nghiệm.
Chỉ tiêu theo dõi
Phương pháp theo dõi bằng cách đo mật độ tế bào (CFU/ml) ở các mức nhiệt độ
25°C, 30°C, 35°C, 40°C theo từng dong vi sinh vật.
2.4.4.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến tăng sinh khối của sinh sinh vat CC —
LD 2.4 và O-BT 1.2
Khao sát pH trong khoảng 5 — 8 với bước nhảy là 0,5. B6 trí thí nghiệm đơn yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại (LLL), mỗi LLL 3 ống nghiệm, quy mô phòng thí
nghiệm.
Chỉ tiêu theo dõi
Phương pháp theo đõi bằng cách do mật độ tế bào (CFU/ml) ở các mức pH = 5,
pH = 5,5, pH = 6, pH = 6,5, pH = 7, pH = 7,5, pH = 8 theo từng dong vi sinh vật.
2.5 Phương pháp xử ly số liệu
Các số liệu được tổng hợp, tính toán bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2010.
Sử dụng phần mềm Microsoft Excel để tổng hợp số liệu, xử lý thống kê theo ANOVA (nếu có), trắc nghiệm phân hạng bằng phần mềm SAS 9.1.
Chương 3