3.1. Dia điểm và thời gian thí nghiệm
Nghiên cứu được tiến hành tại phòng thí nghiệm của Viện Ứng Dụng Công Nghệ và Phát Triển Bền Vững, trường Đại Học Nguyễn Tất Thành (cơ sở TP. Thủ Đức). Thời gian thực hiện từ tháng 6/2022 đến 10/2022.
3.2. Vật liệu, hóa chất, thiết bị và dung cụ nghiên cứu
3.2.1. Vật liệu nghiên cứu
Xoài Tứ Quý mua từ chợ nông sản Thủ Đức được mang về phòng thí nghiệm.
Nguyên liệu được lựa chọn là những trái không bị giập nát, thối hỏng và có khối lượng từ 350 — 700 g/qua, có màu vàng khoảng 2/3 quả hoặc vàng đều xung quanh quả (Hình 3.1). Xoài được rửa 2 lần bằng nước dé loại bỏ bụi ban trên bề mặt trái. Tiếp theo, xoài được tién hành got vỏ và xử lý các phan bị giập hoặc bị hư hỏng trong thịt quả (nếu có).
Thịt quả được tách ra khỏi hạt, xay nhuyễn bằng máy xay (Sunhouse, SHD 5322, Việt Nam) và lọc qua rây để thu puree. Puree xoài được cho vào các túi nhựa PA, ghép mí
và được bao quản ở nhiệt độ -20°C
Lactobacillus plantarum có mật độ 10!! CFU/mL là chế phẩm thương mại được sản xuất bởi công ty Chr. Hansen, Đan Mạch. Chế phẩm được bảo quản ở nhiệt độ
-18°Ctrong tủ đông (Sanaky, VH-2299HY2, Việt Nam).
A B
Hình 3.1 Nguyên liệu (A) xoài Tứ Quy, (B) bột chế phẩm thương mại chứa
Lactobacillus plantarum
3.2.2. Hóa chất và dụng cụ sử dụng
Các hóa chất được sử dụng chính trong nghiên cứu gồm: môi trường Muller-
Hinton Broth (MHB), môi trường Muller-Hinton Agar (MHA), môi trường De Man,
Rogosa and Sharpe agar (MRS agar) được sản xuất từ công ty HiMedia (An Ðộ); sodium hydroxide (NaOH) 0,1N duoc san xuat tir công ty Cemaco (Việt Nam); methanol (CH30H) 99,7% được san xuất từ công ty Chemsol (Việt Nam), phenolphtalein, sodium bicarbonate (Na2CO3) 99,5% được sản xuất từ công ty Xilong (Trung Quéc), Folin- Ciocalteu 2N, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), gallic acid được sản xuất từ công
ty Sigma Aldrich (Đức).
Dụng cụ được sử dụng trong nghiờn cứu gồm: Đĩa peptri ỉ 9cm được sản xuất từ công ty Wertlab (Đức); bình trung tính schott 250 mL sản xuất bởi công ty Duran (Đức); ống nghiệm thủy tinh 25x150mm được sản xuất bởi công ty Pyrex (Mỹ); ống ly tâm 50 mL được sản xuất từ công ty Finetech (Việt Nam); cốc tủy tinh 250 mL, bình định mức 100 mL, ống đong 100 mL, pipette 10 mL được sản xuất từ công ty Onelab (Trung Quốc), micropipette 1000 — 5000 uL, micropipette 100 — 1000 pL được sản xuất từ cụng ty Joanlab (Trung Quốc), giấy lọc ỉ 9mm được sản xuất bởi cụng ty Newstar (Trung Quéc).
3.3. Bồ tri thi nghiệm
3.3.1. Chuan bị chủng khởi động
Lactobacillus plantarum được chuẩn bị bang cách hòa tan 1 + 0,02 g bột chế phẩm trong 9 mL nước muối 0,85% vô trùng thành dung dịch huyền phù. Dung dịch được tiếp tục pha loãng bằng nước muối vô trùng đến mật độ mong muốn. Huyền dịch vi khuẩn được chuan bị 30 phút trước khi được bổ sung vào nước xoài.
3.3.2. Chuẩn bị nước xoài lên men
Chuẩn bị nước xoài: Quy trình chuẩn bị nước xoài được tham khảo từ nghiên cứu của Romila và ctv. (2018) với một số sửa đổi. Hỗn hợp gồm puree xoài (đã chuẩn bị ở mục 3.1.1.), nước và đường saccharose, chất điều chỉnh acid (citric acid hoặc NaHCOs) được trộn đều và gia nhiệt ở 80°Ctrong 1 phút dé hòa tan hoàn tàn các thành phan nguyên liệu. Hỗn hợp có hàm lượng tổng chất ran hòa tan đạt 15 + 0.2%,
pH = 4,04 + 0,07 và hàm lượng acid tổng số đạt 0,17 + 0,02 mg/100mL. Sau đó, 200 mL dung dich được rót vào chai thủy tinh 220 mL và được đậy kin bằng nắp thiếc. Các mẫu được thanh trùng bằng nồi hấp tiệt trùng (Tomy Kogyo, SS 325, Nhật Bản) ở nhiệt độ 80°Ctrong 15 phút. Mẫu sau thanh trùng được làm nguội nhanh trong nước đến nhiệt
độ môi trường (29 — 31°C).
Lên men nước xoài: Nước xoài được bỗ sung huyền phù vi khuẩn (chuẩn bị ở mục 3.3.1.) sao cho mật độ vi khuẩn trong dịch dat 6 log CFU/ml. Các mẫu thí nghiệm tiếp tục được lên men ở nhiệt độ 37°C trong 72 giờ trong tủ ấm (Faithful, DH500011, Trung Quốc). Kết thúc quá trình lên men, mẫu được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ
8 — 10°Ctrong tủ mát (Darling, DL 4000A2, Việt Nam). Các mẫu thí nghiệm được phân tích hóa lý và cảm quan không quá 24 giờ sau khi lên men.
3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ puree xoài đến quá trình lên men lactic
Thí nghiệm được bố trí kiểu 1 yếu tố là tỉ lệ puree xoài trong công thức phối trộn gồm 15%, 20%, 25% và 30% (g/g). Trong đó, mẫu được thực hiện tương tự quy trình đã đề cập trong mục 3.3.2. Tỉ lệ puree xoài được thay đổi theo các thông số bó trí thí nghiệm. Mẫu được ủ ở nhiệt độ 37°C trong 72 giờ trong tủ 4m. Mẫu đối chứng là mẫu nước xoài không bồ sung chủng khởi động và không trải qua quá trình lên men.
Mẫu nước xoài đối chứng và lên men được phân tích các chỉ số gồm hàm lượng tong chat rắn hòa tan, pH, hàm lượng acid tổng số và chất lượng cảm quan.
3.3.4. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng tổng chat rắn hòa tan đến quá trình lên
men
Thí nghiệm được bố trí kiểu 1 yếu tố là hàm lượng tổng chất rắn hòa tan gồm 11%, 13%, 15% và 17% (g/g). Trong đó, mẫu được thực hiện tương tự quy trình đã đề
cập trong mục 3.3.2. với tỉ lệ puree xoài được chọn ở thí nghiệm mục 3.3.3. Tỉ lệ hàm
lượng đường bổ sung được thay đổi theo các thông số bố tri thí nghiệm. Mẫu được ủ ở nhiệt độ 37°Ctrong 72 giờ trong tủ 4m. Mẫu đối chứng là mẫu nước xoài không bồ sung
chủng khởi động và không trải qua quá trình lên men.
Mau đôi chứng và lên men được phân tích các chỉ sô gom hàm lượng tông chat
rắn hòa tan, pH, hàm lượng acid tổng số và chất lượng cảm quan.
3.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của pH nước xoài đến quá trình lên men
Thí nghiệm được thiết kế kiểu 1 yếu tố là các mức pH nước xoài khác nhau gồm:
3, 4, 5 và 6. Trong đó, mẫu được thực hiện tương tự quy trình đã đề cập trong mục 3.3.2.
Tỉ lệ puree xoài và hàm lượng tổng chất rắn hòa tan lần lượt được chọn ở thí nghiệm
mục 3.3.3. và 3.3.4. pH của nước xoài được thay đổi theo các thông số bó trí thí nghiệm.
Mẫu được ủ ở nhiệt độ 37°C trong 72 giờ trong tủ 4m. Mẫu đối chứng là mẫu nước xoài không bồ sung chủng khởi động và không trải qua quá trình lên men.
Mau nước xoài đôi chứng và sau lên men được phân tích các chỉ sô gôm ham
lượng tổng chất rắn hòa tan, pH, hàm lượng acid tổng số và chất lượng cảm quan.
3.3.6. Khảo sát ảnh hưởng của mật độ chủng khởi động đến quá trình lên men Thí nghiệm được thiết kế kiểu 1 yếu tố là mật độ chủng khởi động (log CFU/mL) gom 3, 4, 5 và 6. Trong đó, mẫu được thực hiện tương tự quy trình đã đề cập trong mục 3.3.2. Tỉ lệ puree xoài, hàm lượng tổng chất rắn hòa tan và pH của nước xoài lần lượt
được chọn ở thí nghiệm mục trước đó. Mật độ chủng khởi động trong nước xoài được
thay đổi theo các thông số bồ trí thí nghiệm. Mẫu được ủ ở nhiệt độ 37°C trong 72 giờ trong tủ ấm. Mẫu đối chứng là mẫu nước xoài không bồ sung chủng khởi động và không
trải qua quá trình lên men.
Mau nước xoài đôi chứng và sau lên men được phân tích các chỉ sô sau gôm hàm lượng tông chat ran hòa tan, pH, hàm lượng acid tông sô, mật độ vi khuan lactic tông sô và chât lượng cảm quan.
3.3.7. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian lên men đến quá trình lên men Thí nghiệm được thiết kế kiểu 2 yếu tố, gồm yếu té 1 là nhiệt độ lên men (gồm ba mức: 10 + 1°C nhiệt độ phòng (29 — 31°Q và 37°C + 1°O và yếu tố 2 là thời gian lên men. Cụ thê, đối với mẫu nhiệt độ phòng và 37°C là các mức thời gian gồm 24, 48, 72, 96, 120 giờ. Trong khi đó, đối với mẫu 10°C là 48, 96, 144, 192, 240 giờ. Các mẫu được thực hiện tương tự quy trình đã đề cập trong mục 3.3.2. Tỉ lệ puree xoài, hàm lượng tổng chất ran hòa tan, pH và mật độ chủng khởi động trong nước xoài lần lượt được chọn trong các thí nghiệm ở các mục trước đó. Mẫu được ủ ở nhiệt độ và thời gian theo các thông số bố trí thí nghiệm. Mẫu đối chứng là mẫu nước xoài không bồ sung chủng khởi
động và không trải qua quá trình lên men.
Mau nước xoài sau lên men được phân tích các chỉ tiêu gôm:
Nhóm chỉ tiêu hóa lý: Hàm lượng tổng chat ran hòa tan, pH, hàm lượng acid tổng số, màu sắc (L*, a* và b*), tổng hàm lượng các hợp chất thuộc nhóm phenol (TPC), khả năng kháng oxy hóa bằng thuốc thử DPPH.
Nhóm chỉ tiêu vi sinh: Mật độ vi khuẩn lactic tông số.
3.3.8. Đánh giá tác động của quá trình lên men đến thành phần hóa lý của nước
xoài
Mẫu nước xoài sau lên men ở nhiệt độ phòng (29 — 31°Q trong 48 giờ và mẫu đối chứng (nước xoài sau thanh trùng không lên men) được phân tích các chỉ số sau:
Nhóm chỉ tiêu hóa lý: Ham lượng tổng chat rắn hòa tan, pH, hàm lượng acid tổng số, màu sắc (L*, a* và b*), carbohydrates, chất béo, chất đạm, độ âm, tro tổng, đường tổng, đường khử, chỉ số năng lượng, khả năng kháng oxy hóa, thành phần các hợp chất
bay hơi.
Nhóm chỉ tiêu vi sinh: Mật độ vi khuẩn lactic tong số và khả năng kháng khuẩn.
3.3.9. Đánh giá sự thay đối chất lượng của nước xoài lên men trong quá trình bảo
quản
Quy trình chuẩn bị mẫu được thực hiện tương tự quy trình đã đề cập trong mục 3.3.8. Mẫu được ủ ở nhiệt độ phòng (29 — 31°C) trong 48 giờ trong tủ 4m. Sau khi quá trình lên men hoàn thành, mẫu được bảo quản ở nhiệt độ 8 — 10°Ctrong tủ mát và được mang đi phân tích theo các mốc thời gian trong bồ trí thí nghiệm. Sau các khoảng thời gian gồm 7, 14, 21, 28 và 35 ngày, mẫu bao quản được phân tích các chỉ số gồm mật độ vi khuẩn lactic tổng số, hàm lượng tổng chat rắn hòa tan, pH, hàm lượng acid tổng số và màu sắc (L*, a* và b*), TPC và khả năng kháng oxy hóa.
3.4. Phương pháp phân tích
3.4.1. Trích ly hợp chất sinh học
Phương pháp trích ly các hợp chất sinh học có trong sản phẩm bằng methanol được dựa trên phương pháp của Xu và ctv. (2008) với một số hiệu chỉnh.
Cách tiến hành: Trong ông ly tâm 50 mL, 5 mL mẫu được trộn đều cùng với
20 mL dung môi methanol 80% trong thời gian 30 phút tại nhiệt độ phòng 29 — 31°C,
điều kiện chắn sáng. Tiếp theo mẫu được lọc qua giấy lọc dé thu hồi phan dịch trích trong suốt, dịch trích thu hồi được bảo quản trong chai thủy tinh tối màu tại ngăn mát tủ
lạnh (10 — 12°C) cho các thí nghiệm phân tích sau đó.
3.4.2. Xác định tổng hàm lượng các hợp chất thuộc nhóm phenol Phương pháp được tham chiếu theo Lim và ctv. (2007).
Cách tiến hành: Trong một ỗng nghiệm, lắc đều hỗn hợp gồm 0,3 mL dịch trích và 1,5 mL Folin-Ciocalteu 10%. Mẫu được đề yên trong 5 phút ở điều kiện chắn sáng.
Sau đó, 1,2 mL Na2CO3 7,5% được thêm vào hỗn hợp và lắc đều. Sau 30 phút phản ứng tại nhiệt độ phòng 29 — 31°C, điều kiện chắn sáng, mẫu được phân tích mật độ quang ở bước sóng 765 nm bang máy quang phổ UV-VIS (Thermo Scientific, Evolution 60S, Trung Quốc). Tổng hàm lượng các hợp chất thuộc nhóm phenol của mẫu được thể hiện
là mg đương lượng acid gallic/100 mL.
Công thức tính toán
_y—b) x V x df x 100
LPG = a xm x 1000
Trong đó:
y: giá trị OD của mẫu phân tích.
a và b: hệ số trong phương trình đường chuẩn acid gallic.
V: thé tích dịch trích ly.
df: độ pha loãng.
m: khối lượng của mẫu.
100/1000: hệ số chuyên đổi từ ug/g sang mg/100g.
3.4.3. Xác định hoạt tính kháng oxy hóa bằng thuốc thử DPPH
Phương pháp phân tích sử dụng thuốc thử DPPH được tham chiếu theo Tran và
ctv. (2020).
Chuẩn bị thuốc thir: Hòa tan 3,94 mg DPPH trong 100 ml methanol 99,8% ở diéu
kién tranh sang.
Cách tiến hành: Trong một ống nghiệm 0,1 mL dich trích ly của mẫu được thêm 2 mL dung dịch DPPH. Hỗn hợp được lắc đều và đề 6n định tại nhiệt độ phòng trong 30 phút, điều kiện tránh sáng. Sau đó, mẫu được phân tích mật độ quang tại bước bước sóng 517 nm bằng máy đo quang phổ UV-VIS. Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu được thê hiện là mg đương lượng acid ascorbic/100 mL.
Công thức tính toán
_(y—b) x V x df x 100
were = a xm x 1000
Trong do:
y: giá tri OD của mẫu phân tích.
a và b là hệ số trong phương trình đường chuẩn acid ascorbic.
V: thể tích dịch trích ly.
df: độ pha loãng.
m: khối lượng của mẫu.
100/1000: hệ số chuyên đổi từ ug/g sang mg/100g.
3.4.4. Xác định hoạt tính kháng oxy hóa bằng thuốc thử ABTS
Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa bằng ABTS được tham chiếu theo
Tran va ctv. (2020).
Chuẩn bị thuốc thử
Dung dịch 7mM ABTS: Hòa tan 0,0384 g ABTS trong 10 ml nước cất (dung dịch A), điều kiện tránh sáng.
Chuẩn bị 2,45mM kali Persulfate (K2S2Os): Hòa tan 0,0066 g trong 10 ml nước cat (dung dich B).
Tron một lượng bằng nhau các dung dich A và B và dé trong bóng tối, trong ngăn
mát tủ lạnh, trong 12 — 16 giờ trước khi sử dụng (ABTS stock solution).
Dung dịch thuốc thử phân tích (ABTS working solution) được chuẩn bị bằng cách pha loãng ABTS (stock solution) với nước cat đến độ hap thụ 0,70 (+ 0,02) ở 734 nm và cân bằng ở nhiệt độ phòng).
Cách tiến hành: Dùng micropippete hút 80 pL mẫu vào ống nghiệm. Sau đó dùng pippete hút 3,2 mL dung dich ABTS (working solution) vào ống nghiệm, lắc đều. Mẫu được dé trong bóng tối trong vòng 5 phút, sau đó đo độ hap thụ quang tại bước sóng tại
734nm.
Công thức tính toán
(y—b) x V x df x 100 axXm x 1000
ABTS =
Trong đó:
y: giá trị OD của mẫu phân tích.
a và b là hệ số trong phương trình đường chuẩn acid ascorbic.
V: thé tích dịch trích ly.
df: độ pha loãng.
m: khối lượng của mẫu.
100/1000: hệ số chuyên đổi từ ug/g sang mg/100g.
3.4.5. Xác định thuộc tính màu sắc
Mẫu được xác định bằng máy đo màu (Chroma meter CR400, Nhật Bản). Công thức xác định khác biệt mau sắc (AE) được tham chiếu theo Tuyen và ctv. (2015).
AE= af CEE — L*)? + (ap — a*)? + (bã — b*)?
Trong đó:
AE: sự khác biệt màu sắc.
Lo, dạ. bạ: các giá tri của của mau trước lên men/bảo quan.
L*, a*, b*: giá trị do được của mỗi mẫu tại thời điểm phân tích.
3.4.6. Hàm lượng axit tông sô
Phương pháp phân tích được tham chiếu theo TCVN 5483-2007.
Cách tiến hành: Cho 10 mL mẫu vào trong bình định mức 100 mL, mẫu được định mức đến 100 mL bằng nước cat. Hỗn hợp được lắc đều và lọc qua giấy lọc thu dich
trích. Cho 10 mL dịch trích và 2 giọt phenolphtalein 1% vào trong bình tam giác 100
mL. Mẫu được lắc đều và chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1 N cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 30 giây. Hàm lượng axit trong mẫu được thé hiện là g/100mL.
Công thức tính toan
V, x Ứạ x K x C x100
s V3 x m
Trong do:
TA: ham lượng acid tông số của mẫu (g/100mL) V1: tổng thé tích dịch trích.
V2: thể tích NaOH 0,1N dùng dé chuẩn độ mẫu.
V:: thể tích mẫu đem chuẩn độ.
m: khối lượng mẫu.
K: hệ số acid lactic (0,09).
C: nồng độ NaOH dung dé chuẩn độ.
3.4.5. Xác định hàm lượng tổng chất khô hòa tan
Hàm lượng tổng chat rắn hòa tan được xác định bằng khúc xạ kế cầm tay (Atago,
Nhật Bản).
Cách tiến hành: Lăng kính và tam chắn sáng của khúc xạ kế trước khi được sử dụng phải được rửa sạch bằng nước cất và lau khô bằng khăn giấy sạch, không dé vụn giấy dính trên lăng kính và tam chắn sáng. Mẫu được nhỏ một vài giọt vào lăng kính.
Sau đó, đậy từ từ tam chắn sáng sao cho dung dịch lap đầy mặt kính, không dé lại bọt
khí. Phần lăng kính được hướng ra nguồn sáng, đọc và ghi lại kết quả ở vùng phân chia sang tối trên thang đo qua thị kính.
3.4.6. Xác định pH
Xác định pH của mẫu bang máy do pH (Hanna, HI2211, Mỹ).
Cách tiến hành: Khởi động máy đo pH, rửa đầu điện cực bằng nước cất và lau khô bằng khăn giấy sạch. Sau đó nhúng đầu điện cực vào dung dịch mẫu và ghi lại giá trị cố định trên màn hình. Rửa đầu điện cực bằng nước cất giữa mỗi lần thử mẫu và lặp
lại.
3.4.7. Tính hàm lượng đường bỗ sung
Hàm lượng đường bé sung được tính dựa theo độ Brix của mẫu ban đầu và sau khi b6 sung đường sao cho đạt được độ Brix yêu cầu.
X=(a-daạ— bo) XV
Trong đó:
X: hàm lượng đường cần bồ sung (g).
a: độ brix của mẫu cần đạt được.
ao: độ brix ban đầu của mẫu.
bạ: phần trăm acid tổng số ban đầu của mẫu.
V: Thể tích của mẫu.
3.4.8. Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn lactic tổng số
Mật độ vi khuẩn lactic tổng số được xác định bằng phương pháp đồ đĩa được tham chiếu theo TCVN 7906:2008 (ISO 15214:1998).
Chuẩn bị môi trường MRS agar: Môi trường MRS agar được chuẩn bị giống như trên hướng dan sử dung của sản phẩm. Trộn đều 67,15 g bột môi trường trong 1.000 mL nước cất trong bình shcott và được tuyệt trùng ở nhiệt độ 121°Ctrong 15 phút. Sau đó, môi trường được lắc đều và dé 6n nhiệt ở 55 + 1°Ctrong tủ sấy (Memmert, Đức) trước
khi sử dụng.