I. Sơ lược về cây lúa
1.5. Đặc điểm sinh trưởng, phát triển của cây lúa
a. Các thời kì sinh trưởng, phát triển của cây lúa
Trong suốt quá trình sinh trưởng, phát triển cây lúa trải qua 3 thời kì lớn:
+ Thời kì sinh trưởng, sinh dưỡng: cây lúa hình thành nhánh, lá và thân.
+ Thời kì sinh trưởng, sinh thực: cây lúa hình thành hoa, tập hợp nhiều hoa
thành bông lúa.
+ Thời kì hình thành hat và chín (IRRI-1991): ở các hoa lúa được thụ tinh
xẩy ra quá trình tích lũy tỉnh bột và sự phát triển hoàn thiện của phôi. Nếu
dinh dưỡng đủ, không bị sâu bệnh phá hoại, thời tiết thuận lợi thì các hoa
đã được thụ tinh phát triển thành hạt chấc (Vũ văn Hiển 1999).
b. Các giai đoạn phát triển của cây lúa
Ba thời kì sinh trưởng của cây lúa trải qua 10 giai đoạn phát triển, bắt
Luận văn tốt nghiệp SV : Lương Thi Lệ Thơ
dau từ lúc hạt nứt nanh, nảy mầm đến lúc tạo thành cây con, phát triển, trổ bóng và kết thúc khi hạt chín hoàn toàn (Nguyễn Văn Hoan 2001).
1. 6. Các yếu tố ảnh hường đến sinh trưởng, phát triển cây lúa
a. Nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của cây lúa: sự nảy
mắm, sự ra lá và nhánh, sự làm đòng và quá trình trổ bông, su làm hạt
và chín, Trong suốt vụ lúa nhiệt độ trung bình, tổng số nhiệt độ, sự thay đổi nhiệt độ, biên độ nhiệt giữa ngày và đêm .. đều có ảnh hưởng đến
năng suất lúa (Vũ Văn Hiển 1999).
b. Anh sang
Ánh sáng ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây lúa có hai mat là cường độ
ánh sáng và số giờ chiếu sáng trong ngày. Cây lúa thuộc loại cây ngắn ngày tức là trong diéu kiện số giờ chiếu sáng trong ngày ở một mức độ
nhất định (nhỏ hơn 13 giờ trong một ngày) thì mới trổ bông, ra hoa, kết
quả được (Binh Văn Lữ 1978), Ngoài ra, ánh sáng cần cho sự đẻ nhánh
của lúa, Gốc lúa có được chiếu sáng thì các m4m nách mới dé phát triển
thành nhánh. Nếu cấy dày, các bụi lúa sớm chạm lá nhau thì thời gian
đẻ nhánh ngắn và đẻ ngọn (Vũ Văn Hiển 1999).
c. Nước
Là yếu tố quan trọng bậc nhất đối với cây lúa. Tưới nước cho cây lúa
trong mùa khô, nắng nhiều là biện pháp tăng năng suất một cách chắc chắn. Lượng mưa cần thiết cho cây lúa trung bình 6 - 7 mm / ngày trong mùa mưa và mùa khô là § - 9 mm / ngày (Dinh Văn Lữ 1978). Độ ẩm
Luận văn tốt nghiệp SV : Lương Thị Lệ Thơ
không khí cũng ảnh hưởng đến cây lúa vì nó chi phối sự thoát nước của lá, quá trình trổ bông và phơi màu (Vũ Văn Hiển 1999).
d. Chất dinh dưỡng
Nói chung, các chất dinh dưỡng đều có ảnh hưởng lên toàn bộ quá trình
sống của cây lúa. Đạm tham gia hình thành nên các loại prôtêin cần thiết cho cây, lân giúp cho quá trình phân bào, khi cây tạo hạt, kali giúp tổng hợp
đường thành tinh bột, giúp cây gia tăng sức chống chịu...
Các nguyên tố vi lượng như sắt, mangan, kẽm, đồng...tham gia trong quá trình sinh trưởng và oxid hóa - khử ... (Vũ Văn Hiển 1999),
2. Nuôi cấy mô thực vật
2.1. Lịch sử nuôi cấy mô
Haberlandt (1902) là người đầu tiên để xuất phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào.
- Đến những năm 30 của thé ki thứ XX, phương pháp nuôi cấy mô và tế bào đã mang những nét của nuôi cấy mô và tế bào hiện đại và không
khác nhiều vé mặt kĩ thuật. Cũng từ đây nuôi cấy mô và tế bào đã phát
triển thành một số hướng như: nuôi cấy phôi, nuôi cấy mô và cơ quan tách
rời.
~ Từ những năm 60 trở lại đây, ngoài các hướng trên thì nuôi cấy bao
phấn, hạt phấn, nuôi cấy tế bào đơn và tế bào trần (protoplast) được phát triển mạnh.
- Từ những năm 70 đến nay, các kĩ thuật lai xôma bằng dung hợp tế bào trần và các kĩ thuật chuyển gen được phát triển và thu được những thành tưu đáng kể (Nguyễn Đức Thành 2000).
10
Luận van tốt nghiệp SV : Lương Thi Lệ Thơ
2.2.Các kĩ thuật nuôi cấy mô
3.2.1.Nuôi cấy phôi
Thường để nuôi phôi người ta sử dụng các phương pháp sau :
Cay ghép phôi vào mô nhũ của cây khác trong diéu kiện tự nhiên
(Sungl 1997).
- Cay ghép phôi vào mô nhũ của cây khác trong điều kiện in vitro
(Kruse 1974),
Nuôi cấy in vitro
Đối với nuôi cấy phôi, đường đóng vai trò rất quan trọng. Trong nhiều trường hợp đường sucrose cho kết quả tốt hơn các đường khác. Nông độ sucrose có thể dùng từ 0,5% - 18%. Ngoài ra một số chất tự nhiên như nước đừa (Overbeek 1942), nước chiết malt (Blackeslee và Satina 1944), casein
thủy phân (Ziebur and Brink 1951) là những chất rất cẩn trong nuôi cấy
phôi.
Các chất kích thích sinh trưởng như giberelin, auxin, cytokinin thường
được dùng nhiều trong nuôi cấy phôi.
Các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng cũng ảnh hưởng nhiều đến su phát triển của phôi nuôi cấy in vitro. Thường phôi nuôi cấy cần nhiệt độ và ánh sáng thấp hơn so với phôi phát triển ngoài tự nhiên.
Nuôi cấy phôi được sử dụng để phá ngủ ở hạt, thử sức sống của hạt và để duy trì những phôi yếu và cứu phôi lai xa (Nguyễn Đức Thành 2000).
2.2.2. Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời
Nhu cầu dinh dưỡng khi nuôi cấy các bộ phận khác nhau của cây rất khác nhau nhưng có thể thấy một số yêu cầu chung như nguồn cacbon dưới
Luận văn tốt nghiệp SV : Lương Thị Lệ Thơ
dang đường và các muối của các nguyên tố đa lượng (N. P, K, Ca...) và vi
lượng (Mg, Fe, Mn, Zn,Co..). Ngoài ra cẩn một số chất đặc biệt như
Vitamin ( B, Bg, axit nicotinic ) và các chất điều hòa.
Đối với nuôi cấy mô, ngoài những thành phần dinh dưỡng như đối với nuôi cấy cơ quan tách rời, cin bổ sung thêm các chất hữu cơ chứa ít nitơ
dưới dang các axit amin, đường rượu và inositol. Trong trường hợp nuôi cấy mô, các chất điều hòa sinh trưởng có vai trò quan trong hơn vì các mô tách
rời không có khả năng tổng hợp các chất này.
Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời được sử dụng để nghiên cứu điều kiện dinh dưỡng đối các bộ phận và mô khác nhau của các cây, để nhân cây in
vitro, để tạo mô seo phục vụ cho các nghiên cứu cơ bản và ứng dụng như
phân hóa tế bào và cơ quan, tạo nghiên liệu để chọn dòng tế bào..(Nguyễn
Đức Thành 2000).
2.2.3. Sự tạo mô seo trong nuôi cấy in vitro
Mô seo là một khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ các mô hay cơ quan đã phân hóa đưới các điều kiện đặc biệt như vết thương, xử lý các chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Ngoại trừ các tế bào của mô phân sinh,
các tế bào thuộc các mô hay cơ quan trên phải chịu một sự phản phân hóa
trước lần phân chia đầu tiên (Bùi Trang Việt 1998). Sự phản phân hóa có
vai trò quan trọng, nó cho phép một tế bào trưởng thành trở lại trạng thái
trẻ hóa. Sự trẻ hóa giúp tế bào tái lập khả năng phân chia và tạo phôi thể hệ trong điều kiện thích hợp. Tuy nhiên khả năng tạo phôi thể hệ trong
nuôi cấy mô thực vật, ngoài các điều kiện vật lí, hóa học thuận lợi cho sự tạo phôi. còn phụ thuộc rất lớn vào loài, vào các giống, chủng trong cùng
12
Luận văn tốt nghiệp SV : Lương Thị Lệ Thơ
một loài. Khả năng này đã được chứng minh là do một hoặc vài gen phụ
trách. Vì vậy bằng biện pháp lai tạo có thể chuyển khả năng tao phôi vô tính cao từ cây này sang cây khác (Trần Thị Bích Trinh 2000).
Mô seo thường được tạo ra trong quá trình tạo cơ quan của thực vật, đặc
biệt là trong quá trình tạo rễ. Do đó cây non hay những mảnh thân non của cây trưởng thành dễ tao mô seo. Ngược lại những mảnh cơ quan trưởng
thành thường không có khả năng tao mới cơ quan, cũng không có khả năng
tạo mô seo (Bùi Trang Việt 2000).
Nhìn chung sự tạo mô seo in vitro, nhờ auxin, thuộc về | trong 3 quá
trình:
+ Sự phản phân hóa các tế bào nhu mô (nhu mô mộc, libe, nhu mô vỏ,
nhu mô tủy).
+ Sự phân chia của các tế bào tượng ting (tang phát sinh libe - mộc).
Các tế bào tượng ting của phần lớn song tử diệp dé dàng phân chia đưới tác động của auxin thậm chí không can auxin ngoại sinh như ở các loài cỏ
hay dây leo.
+ Sự xáo trộn các mô phân sinh sơ khởi. Quá trình này được ưu tiên áp
dụng ở đơn tử diệp vì ở các cây này, tượng tầng thường thiếu và tế bào nhu
mô khó phản phân hóa so với song tử điệp (Bùi Trang Việt 2000).
Đối với lúa, mô sẹo thường được tạo ra từ thuẫn của phôi non hay phôi trưởng thành (Trẩn Thị Bích Trinh 2000 ). Thuẫn là một cấu trúc hình khién, bể mật xa trục mở rộng của nó mang một biểu bì tiết gắn liền với nội nhũ. Cùng với lớp aleuron, thuẫn là nơi chứa các enzym phân hủy các chất
dự trữ trong nội nhũ (Esau 1967). Theo một số quan điểm thông thường,
13
Luận văn tốt nghiệp SV : Lương Thị Lệ Thơ
thuấn được coi như một lá mầm, bao chổi mam (lá đầu tiên) và khoảng trục mam giữa hai phần đó là lóng đầu tiên (Tran Thi Bích Trinh 2000).
2.2.4. Sự sinh phôi thể hệ
Phôi thể hệ là phôi được tạo từ tế bào thể hệ (tế bào cơ thể, 2n) theo con đường sinh phôi thể hệ. Đó là quá trình mà qua đó một hay vài tế bào thể hệ trong các điều kiện thực nghiệm (bao gồm việc ấp dụng các chất điểu hòa sinh trưởng thực vật) có thể dấn thân vào một phân chia theo trật
tự nhất định để cho một phôi. theo kiểu giống hoặc gan giống như kiểu sinh
phôi hợp tử (Bùi Trang Việt 2000).
- GO thực vật con đường sinh phôi thể hệ có thể tóm tất qua các giai
đoạn:
Mô cấy — Mô sẹo -> Dịch treo tế bào -> Cây tái sinh
len _==—==i qua con đường
sinh phôi thể hệ
(Trần Thị Bích Trinh 2000).
- (62 giai đoạn quan trọng trong sự thu nhận phôi thể hệ:
+ Giai đoạn 1: Tạo các tế bào sinh phôi (trong mô seo, dich treo) giai đoạn này cần sự hiện diện của auxin, riêng lẻ hay kết hợp với cytokinin.
+ Giai đoạn 2: Tiến hóa phôi thể hệ, với sự giảm hay loại bỏ auxin trong môi trường nuôi cấy (Bùi Trang Việt 2000).
- Bên cạnh auxin mật độ tế bào trong môi trường nuôi cấy có vai trò quan trọng trong sư nuôi cấy tế bào. Ngoài ra, các hoocmôn tăng trưởng và các yếu tố vật lí, hóa học khác nhau cũng có vai trò nhất định trong một vài
trường hợp (Bùi Trang Việt 2000).
14
Luận văn tốt nghiệp SV : Lương Thị Lệ Thơ
Tuy nhiên sự sinh phôi thể hệ có thể là trực tiếp đặc trưng bởi sự tiến hóa của tế bào sinh phôi không qua giai đoan mô seo (trường hợp đặc
biệt), nhưng nói chung sự sinh phôi thể hệ thường phải qua giai đoạn tao mô sẹo và dịch treo có chứa các tế bào sinh phôi (Bùi Trang Việt 2000).
Theo Nabors và csv, 1983, các khối mô có khả năng sinh phôi có khả năng phân biệt với những khối mô không có khả năng sinh phôi bằng cách quan sát hình đạng các khối mô có khả năng sinh phôi gồm các tế bào có những đặc tính hình thái tế bào học giống tế bào phân sinh: đó là những
tế bào có kích thướt nhỏ. đẳng kính, vách mỏng, tế bào chất đậm đặc, nhân
to, hạch nhân dam mau va khá to (Bùi Trang Việt 2000).
2.3. Sự phân hóa và hình thành cơ quan trong mô và tế bào nuôi cấy
in vitro
Trong các tế bào nuôi cấy thường xảy ra hai dang phân hóa đó là phân hóa cơ quan bằng con đường hình thành nhu mô và phân hóa cơ quan trong
sự tạo phôi xôma.
2.3.1. Phân hóa nhu mô
Sự phân hóa nhu mô trong nuôi cấy in vitro được bất đầu bằng sự ngừng phân hóa và tạo thành mô sẹo, một tổ chức tế bào không phân hóa. Dưới tác dụng của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật và các yếu tố của môi trường nuôi cấy khả năng phân hóa của các mô mất phân hóa lại được khôi
phục và phân hóa thành cơ thể hoàn chỉnh.
2.3.1.1. Phân hóa mô
Để nghiên cứu sự phân hóa ở mô nuôi cấy, người ta thường sử dụng việc
nuôi cấy các mô thân và mô đầu rễ. Gautheret (1959) đã mô tả chỉ tiết về
15
Luận văn tốt nghiệp SV : Lương Thị Lệ Thơ
sinh trưởng của mô nuôi cấy như sau: các tế bào chuẩn bị phân hóa thường
chứa lượng nhu mô lớn, các không bào hợp lại thành nhóm. Khi những mô
này tăng trưởng châm thì các mô mạch được tạo thành.
2.3.1.2, Phân hóa cơ quan
- Trong quá trình phân hóa cơ quan, ở những mô sẹo không có tổ chức được hình thành các cấu trúc hình thái dẫn đến việc tạo chổi, rễ, cành. hoa
và cây hoàn chỉnh. Quá trình phân hóa này có thể thực hiện bằng cách thay
đổi một số chất và các chất điều hòa sinh trưởng trong môi trường nuôi cấy.
Quá trình hình thành cơ quan trong mô xảy ra qua hai giai đoạn:
+ Giai đoạn một là tái phân hóa: Trong giai đoạn này xảy ra quá trình
chuyến các tế bào biệt hóa thành mô sẹo.
+ Giai đoạn hai là hình thành các mam mống cơ quan. Bằng phương pháp phóng xạ tế bào đã thấy rằng những tế bao của các mim mống nhu mô mà ở đấy được hình thành mim mống cơ quan, tổng hợp ADN va protéin xảy ra rất mạnh (Dalina 1974) và hàm lượng đường cũng phát triển
(Thorpr 1972).
-_ Khả nang hình thành cơ quan ở các mô khác nhau của cây giảm dần
từ ngọn đến gốc (Galston 1968, Murashige 1974). Đối với mô sẹo, xu thế
tạo cơ quan giảm dần khi mô cấy chuyển nhiều lan vì khi mô cấy chuyển nhiều lần thường hình thành các tế bào đa bội, ngoài ra có thể mất các yếu tố di truyền.
Nhờ sự phân hóa của mô nuôi cấy mà tế bào đã tái phân hóa để tạo thành tế bào mới của mô thực vật nuôi cấy và tạo thành cơ thể hoàn chỉnh (Nguyễn Đức Thành 2000).
16
Luận văn tốt nghiệp SV: Lương Thị Lệ Thơ
2.3.2. Phân hóa phôi
Sự phân hóa phôi bất đầu bằng sự tái phân hóa của các tế bào đã biệt
hóa trong mô nuôi cấy và sau đó xảy ra quá trình tạo phôi. Steward và esv
(1958) đã mô tả sự hình thành cấu trúc phôi trong tế bào cà rốt nuôi cấy
trong môi trường lỏng. Đầu tiên tế bào phân chia manh để tạo thành các cụm tế bào. Trong các cụm này các phần tử của mạch gỗ được hình thành sau đó xảy ra quá trình tạo mầm mống rễ. Khi chuyển sang môi trường nuôi
cấy tiếp thì quan sát thấy hình thành phôi và sau đó là cây hoàn chỉnh,
Cả hai quá trình phân hóa nhu mô và phân hóa phôi để hình thành các cơ quan như chổi. rể... đều chịu tác động của các chất kích thích sinh trưởng
và điều kiện nuôi cấy (Nguyễn Đức Thành 2000).
3. Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong nuôi cấy mô
thực vật
3.1. Auxin
~ Chất auxin tự nhiên được tim thấy nhiều ở thực vật là axit Indol
axetic (AIA): có tác dụng kích thích sinh trưởng, kéo dài tế bao và điều
khiển sự hình thành rễ (Nguyễn Đức Thành 2000).
- Sự hiện diện của các chất diéu hòa sinh trưởng thực vật trong nuôi cấy mô đặc biệt là auxin, riêng lẻ hay kết hợp với cytokinin, cần thiết cho
su cảm ứng tạo mô sẹo có khả nang sinh phôi. Auxin được tổng hợp ở trong
ngọn thân, trong mô phân sinh (ngọn và lóng) và lá non (tức là nơi có sự
phân chia tế bào nhanh) từ triptophan được tổng hợp trong lá trưởng thành đưới tác dụng của ánh sáng. Sau đó. auxin đi chuyển đến rễ và tích tụ trong
rẻ (Bùi Trang Việt 2000).
17
Luân văn tốt nghiệp SV : Lương Thị Lệ Thơ
Ngoài ra, các auxin khác như AIA, NAA cũng được sử dụng để cảm
ứng tạo mô seo ở một số mô cấy (Trần Thị Bích Trinh 2000).
3.2. Giberelin (GA)
- Có tác dụng kéo đài tế bào, nhất là thân và lá. GA còn kích thích sự phân chia tế bào nhu mô và biểu bì. kích thích sự nảy mam của hạt giống,
làm châm sự ngủ của chổi và gỡ sư ngủ do hiệu ứng của axit abcisic (Bùi
Trang Việt 2000).
- Tuy nhiên, GA ít có ảnh hưởng trên sự hình thành mô sẹo. Do đó GA
rất hiếm được sử dụng trong nuôi cấy tạo mô sẹo và môi trường tái sinh
(Trần Thị Bích Trinh 2000),
3.3. Cytokinin
- Có tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào, tăng kích thước tế bào và
sinh tổng hợp protéin (Bùi Trang Việt 2000).
-_ Tác dụng phối hợp của auxin va cytokinin có tác dụng quyết định đến sự phát triển và phát sinh hình thái của tế bào và mô.
+ Nếu tỷ lệ auxin / cytokinin cao thì thích hợp cho hình thành rễ.
+ Nếu tỷ lệ auxin / cytokinin thấp thì kích thích quá trình phát sinh chổi.
+ Nếu tỷ lệ auxin / cytokinin bằng nhau thì thuận lợi cho phát triển mô
seo (Bùi Trang Việt 2000).
~ Đo đó cytokinin thường được sử dụng trong môi trường cảm ứng tạo
mô sco ở một số cây lương thực. Tuy nhiên cytokinin có vai trò quan trọng
trong việc thúc đẩy sự trưởng thành của phôi thể hệ hơn là trong su tạo mô seo (Trần Thị Bích Trinh 2000).
18