VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chờ 3 5 phút để huyén phù loang đều khung đếm, đặt lên kính hiển vi quan sát ở vật kính x 40
11.3. Chuẩn bị môi trường lên men
ich i mì và hóa :
Củ khoai mì tươi lột vỏ, cắt nhỏ, ngâm nước trong 2 giờ. Sau đó, vớt
khoai mì ,vắt ráo rồi ngâm vào nước tro 3% ở nhiệt độ 41°C/ 24 giờ. Tiếp
đến, ta hấp khoai mì ở latm/30' rồi hòa với nước, nghiển nát bằng máy xay sinh tố, loc qua rây loại bỏ xơ để thu được dịch khoai mì theo tỉ lệ 1kg
khoai mì ban đầu thì được 2,4 lít dịch khoai mì.
Tiến hành hổ hóa bằng cách đun sôi dịch khoai mì. Sau đó, ta tiến hành dịch hóa bằng enzim Termamy 120L (œ-amylaza) với tỉ lệ 0,5
ml/lkg chất khô, ở nhiệt độ 95°C trong 15 phút. Kết thúc dich hóa, đun sôi
dịch khoai mì để điệt enzim trên.
Tiếp theo, cho enzim Fungamyl 800L theo tỉ lệ Iml/kg chất khô vào
dịch cháo khoai mì để đường hóa ở 65° ,pH=5,5-6,0.Thời gian đường hóa
càng lâu, glucose tạo ra càng nhiều.
Chú ý, trong khi hổ hóa, địch hóa và đường hóa phải khuấy đều để tránh tình trạng enzim không tiếp xúc đều với dịch tỉnh bột khoai mì.
II.3,2 Thăm dò một số điểu kiện cho môi trường lên men :
Trang 30
e Thăm dò nồng độ đường thích hợp:
Chuẩn bị dich cháo khoai mì chưa đường hóa, bổ sung đường :
- 10% glucose + 5% saccharose - 10% glucose+ 3% saccharose - 12% glucose + 3% saccharose
- 12% glucose+ 5% saccharose
Tiến hành lên men, theo đõi thời gian bắt men, màu sắc, mùi vị của môi
trường lên men để chọn được néng độ đường thích hợp nhất là
10%glucose +5%saccharose.
s® Thăm dò chế độ hấp môi trường:
Cháo khoai mì bổ sung đường theo tì lệ 12% glucose + 5%
saccharose và 15ml dịch chiết đậu nành/1 môi trường. Phân phối vào bình tam giác 100 ml rồi hấp khử trùng ở các chế độ khác nhau : 1
atm/15`;1 atm/30’;1,5 atm/15’;1,5 atm/30°;2 atm/15';
2 atm/30';2,5 atm/15';2,5 atm/30'.
Theo dõi khả năng bắt men, màu sắc, mùi vị của môi trường và căn
cứ vào điều kiện cơ sở vật chất phòng thí nghiệm, chúng tôi chọn chế độ vô trùng là | atm/30'. Chế độ hấp này làm môi trường có mùi thơm của
đậu xanh, có vị béo, màu sắc khá đẹp.
Trên cơ sở này, chúng tôi làm môi trường với điều kiện sau:
Dịch cháo khoai mì 12% glucose 1000ml
Saccharose 50g
Nước chiết đậu nành I5ml Hấp khử trùng latm/30'.
Trang 31
Giống nấm men sau khi hoạt hóa trong môi trường [L3.2] 24 giờ,
được nhân giống trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút, 21 giờ. Thu sinh
khối bằng máy ly tâm lạnh ở tốc độ 3000 vòng/5 phút. Bổ sung lượng
giống từng chủng là 0,3 g/l vào môi trường lên men.
Xác địng số lượng tế bào tại các thời điểm lên men 0, 4, 6, 8, 10 giờ.
Vì môi trường lên men là dịch khoai mì hơi đục, nên để dễ dàng đếm số
lượng tế bào, ta phải tiến hành pha loãng mẫu (2 lần), lọc qua vải rồi đếm
số lượng tế bào trong dịch trong thu được này, sau đó phải nhân với pha
loãng và hệ số lọc,ta được số tế bào nấm men tại thời điểm đó.
Cách tính hệ số lọc :
Cho 0,03g giống vào 100ml nước cất và lượng giống tương đương như vậy
vào môi trường lên men trong bình tam giác (100ml). Sau đó, pha loãng
môi trường lên men đến độ loãng thích hợp (2 lần), lọc qua vải. Đếm số
lượng tế bào nấm men trong nước cất (a) và trong dịch pha loãng của môi trường lên men (b). Hệ số lọc : a/b.
Thực hiện việc lên men trong bình tam giác chứa 100ml môi trường
đã chuẩn bị và không thông khí, tỉ lệ giống cấy là 0,3 g/1 cho từng chủng.
Theo dõi sự giảm đường tại thời điểm 0, 4, 6, 8, 10 giờ lên men với từng
chủng bằng phương pháp so màu trên máy quang phổ.
Trang 32
Nguyên tắc : Xác định lượng đường trong mẫu dựa trên phản ứng màu đặc trưng cho bởi đường va chất hữu cơ với sự hiện diện của H;SO;
đặc.
Cách làm :
Để xác định hàm lượng đường trong dịch nuôi cấy, chúng tôi dùng
phương pháp so màu trên máy đo quang phổ ở bước sóng 490 nm. Các
bước tiến hành như sau:
-Bước 1: Thiết lập 46 thị chuẩn và mối tương quan giữa hàm lượng glucose chuẩn với OD 490.
Chẩn bị dung dich glucose chuẩn với các néng độ sau:10, 20, 30, 40,
50, 60,70 mg/l.
Tiến hành phản ứng mau như sau: Cho dung dịch glucose chuẩn
phản ứng màu với phenol và acid sulfuric đậm đặc theo tỷ lệ dung dịch
glucose chuẩn : phenol: acid sulfuric là 1:1:5. Xác định độ hấp thu (OD)
bằng máy đo quang phổ UV-1601 PC Shimadzu ở bước sóng 490nm.
-Bước 2:Xác định hàm lượng glucose trong dung dịch nghiên cứu tại
các thời điểm lên men 0, 4, 6, 8,10.
Cân lg mẫu
Dùng cồn 90° nóng với tỷ lệ 10 cồn :1 mẫu để chiết dich đường.
Dùng cồn 80° trích ly tương tự 2 lần nữa.
Lọc lấy dịch chiết thu được rồi làm bay hơi đến cạn khô.
Pha nước cất vào phần cạn khô đến 1000ml.
Trang 33
Thực hiện phản ứng màu tương tự bước 1, chỉ khác là dung dịch
glucose chuẩn được thay thế bằng dịch mẫu pha loãng. Từ giá trị OD đo được, căn cứ trên đồ thị chuẩn ta có nổng độ đường trong dịch nghiên cứu.
Nguyên tắc: Úc chế sự phát triển của vi sinh vật bằng cách đưa
chúng vào diéu kiện lạnh sâu một cách từ từ với sự có mặt của chất bảo vệ là sữa gầy 20%,
Phương pháp:
Cấy nấm men vào môi trường hoạt hóa, lắc trong 24 giờ. Đưa nấm men đã hoạt hóa vào môi trường nhân giống, lắc đến pha logarit (18 giờ).
Trang 34
Lấy 200 ul dịch nuôi cấy này cho vào môi trường nhân giống mới ở 37°C,
ủ trong 2 giờ. Sau đó, lấy 100ul dịch nấm men trong môi trường mới cho vào ống eppendoff chứa sẩn 900 ul sữa gầy tiệt trùng, lắc đều. Tiếp theo, lấy 100 yl dich nấm men trong ống eppendoff trên cho vào ống eppendoff mới đã tiệt trùng, dán kín miệng ống bằng keo parafin. Dùng kim gút đục khoảng 7-8 lỗ trên mặt keo rồi đặt các ống này vào tủ lạnh nhiệt độ - 20°C/30' để lạnh đông.
Sau đó, đưa các ống eppndoff này vào thiết bị làm khô khoảng 2 giờ, đậy nắp lại và dán kín bằng keo parafin.
Bảo quản các ống ở nhiệt độ phòng, nhưng tốt nhất ở nhiệt độ 4-6°C
Trang 35
PHAN III