2.1 Nội dung nghiên cứu
Phân lập và định danh nam gây bệnh héo vàng trên cây chuối già Nam Mỹ bằng đặc điểm hình thái.
Đánh giá kha năng ức chế của các vật liệu nano đến sự phát triển của nam Fusarium oxysporum Ÿ sp. cubense gây héo vàng chuỗi trong điều kiện phòng thí
nghiệm và nhà lưới.
Đánh giá được tác động của các vật liệu nano đến sự nảy mam của bào tử.
2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
2.2.1 Thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 5 năm 2023 đến tháng 11 năm 2023 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu
Thí nghiệm được tiễn hành tại phòng thí nghiệm Bệnh cây Bộ môn Bảo vệ Thục
vật và nhà lưới thuộc trại Thực nghiệm khoa Nông học, trường Đại học Nông Lâm TP.HCM
2.3 Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu
2.3.1 Vật liệu nghiên cứu
Mẫu chuối được thu thập tại tinh Tiền Giang giống chuối già Nam Mỹ nuôi cấy mô Thuốc hóa học tiltsuper 300EC (hoạt chất Difenoconazole và Propiconazole) thuộc công ty TNHH Syngenta được sử dụng theo nồng độ huyền cáo (2 ml/L), đã được thương mại trên thị trường, khuyến cáo đặc trị các bệnh do nắm.
Thuốc nano đối chứng đương được thực hiện trong thí nghiệm Fungy Max Gold
18EC (18% hỗn hợp tinh dầu và hoạt chat nano đồng 1500 ppm) của Công ty TNHH công nghệ TANIXA sử dụng nồng độ 16 ppm
Các vật liệu nano được sử dụng trong thí nghiệm:
AgS1O2 — cts: nano bạc - silica
AgNPs — cts: nano bạc sử dụng chat bảo vệ chitosan (cts)
CuNPs : nano đồng sử dụng chitosan (cts) nồng độ 0,4 g/mL làm chất bảo vệ CuSiO›: composit đồng-silica sử dụng chitosan nồng độ 0,4 g/mL làm chất bảo vệ AgCuSiO›: composite bạc đồng-silica sử dụng chitosan (cts) 1% làm chat bảo vệ
Các vật liệu tổng hợp theo phương pháp khử hóa học và được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu Green Nano Lab thuộc Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia TP.HCM. Kết quả phô hap thụ UV — Vis của vật liệu AgNPs — cts, AgSiO› — cts ở vị trí khoảng 400 nm, là đỉnh plasmon bề mặt của nano bạc. các vật liệu CuNPs, CuSiO2 có đỉnh hấp thụ ở vị trí khoảng 560 — 570 nm, thể hiện đỉnh đặc trưng của nano đồng và nano đồng trên bề mặt silica. Vật liệu AgCuSiO2 có 2 đỉnh plasmon tại vị trí 400 nm và 560 nm thể hiện sự có mặt của nano đồng và nano bạc trên bề mặt silica.
2.3.2 Dụng cụ thí nghiệm
Dụng cụ thí nghiệm trong phòng: Dia petri nước cất khử trùng, cồn 96°, que cấy, vải lọc, quặng đong, số ghi chép, bông gòn hút nước, hộp nhựa, đèn cồn
Thiết bị thí nghiệm trong phòng: Tủ cấy khử trùng (2AC2 - 6E8, Esco, Singapore), máy hấp khử trùng (MC40L, ALP, Japan), máy sấy khử trùng (IN110, Memmert, German), kính hién vi, cân điện tử, bếp điện từ.
Môi trường WA: Dùng để phân lập nam Fusarium oxysporum f. sp. cubense gồm: 20 g agar;1L nước cất.
Môi trường PGA : Nuôi cấy nam Foc 200 g khoai tây; 20 g glucose; 20 g Agar:
1000 mL nước cat.
Foc: 600 g cà rốt; 15 g agar; 15 g CaCOs; IL nước cat
Môi trường CA: khảo sát sự sinh trưởng va phát triển của nam Foc: 200 g ca rốt; 20 g agar; 1L nước cat.
Môi trường cơm: Xác định chủng nam Foc: 30 g gạo; 90 mL nước cất Tất cả các môi trường này đều được hấp khử trùng trong nôi hap (121°C).
2.4 Phương pháp thí nghiệm
2.4.1 Định danh tác nhân gây bệnh héo vàng trên chuối già Nam Mỹ bằng đặc điểm
hình thái.
Phương pháp nghiên cứu
Áp dụng phương pháp của Burgess và ctv (2009) cho việc phân lập nắm từ củ,
thân, lá được thực hiện như sau:
Phương pháp phân lập: Rửa sạch mau củ, thân, lá đưới voi nước dé loại bỏ đất và các vi sinh vật hoại sinh bám ở ngoài thân. Cắt củ, thân, lá thành những đoạn dài 2 cm tại phần ranh giới giữa mô bệnh va mô khỏe. Khử trùng mẫu bằng ethanol 70%
trong 15 giây sau đó rửa bằng nước cat vô trùng. Cay mẫu lên môi trường WA, sau khi cấy xong đặt ngược dia petri dé tránh đọng hơi nước trên bề mặt môi trường cấy, tiếp đến đặt đĩa petri trong điều kiện nhiệt độ phòng. Khi các mẫu nắm bắt đầu xuất hiện từ các mau cấy tiễn hành cấy truyền đỉnh sinh trưởng sợi nam lên môi trường PGA. Làm
thuân mau nam bang cách tiêp tục cây đỉnh sinh trưởng của sợi nam.
Xác định ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng PGA, PCA, CRA, CA đến nam Foc (Vũ Thị Phương Bình và ctv, 2021). Sau khi làm thuần nam Foc bằng cách cấy truyền đơn bảo tử trên môi trường PGA thì tiếp tục các truyền trên các môi trường dinh dưỡng dé xác định nắm Foc bằng cách quan sát đặc điểm hình thái và tốc độ sinh trưởng trên các môi trường dinh dưỡng để tìm ra môi trường nhân nuôi tốt nhất. Các môi trường dinh dưỡng sau khi hap khử trùng thì tiến hành cắt các khoanh nam có đường kính 0,5 cm đặt trên bề mặt môi trường dinh dưỡng cho nam tiếp xúc với mặt môi trường sau đó
tiên hành quan sát hình thai mau sắc tan nam 5 ngay sau cây.
Nhân nuôi nam Foc đê xác định chủng nam trên môi trường tinh bột được chuân
bị bằng cách: Cân 30 g gạo cho vào bình tam giác thủy tỉnh tiếp tục cho thêm 90 ml nước cất vào bình đem đi hấp khử trùng. Sau đó cấy chuyền tan nấm vào bình môi trường tinh bột, đặt ở nhiệt độ phòng, sau 15 ngày nuôi cay sé kiém tra được mau sac va
mui dac trung (Moore va ctv, 1993).
Định danh nam Fusarium oxysporum f.sb. cubense dựa vào đặc điểm hình thái.
Quan sát hình thái bao tử được nuôi trên môi trường PGA sau 5 - 7 ngày nuôi cay dưới kính hiên vi với độ phóng đại 40X. Các chỉ tiêu quan sát bao gôm: mô tả đặc diém mau sắc tan nam, sợi nam, hình thái bao tử, loại bao tử, sô vách ngăn, hình dạng chiêu dai chiêu rộng của bao tử.
Mau sắc và mùi đặc trưng tạo ra khi nuôi cây trên môi trường tinh bột là cơ sở xác định chủng nâm.
Quan sát hình dang và màu sắc và đường kính tan nam 5 ngày sau cây trên các môi trường dinh dưỡng tìm ra môi trường tot nhât đê nhân nuôi nam Foc .
2.4.2 Hiệu lực ức chế của các vật liệu nano đến sự phát triển của tan nam Foc trong
điều kiện phòng thí nghiệm
Phương pháp nghiên cứu
Thí nghiệm đơn yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngầu nhiên với 7 NT, 3LLL, mỗi lần lặp lại là một đĩa petr1. Gồm có:
Nano AgSiO¿- cts, AgNPs — cts, AgCuSiO2, CuSiO2, CuNPs mỗi nghiệm thức là mot nong độ thuốc nano thi nghiém (16, 32, 64, 128, 256 ppm), NT đối chứng (PGA),
1 NT thuốc Fungy Max Gold 18 EC (nồng độ 16 ppm).
Nano AgSiO>- cts, AgNPs — cts, AgCuSiO2, CuSiO2, CuNPs mỗi nghiệm thức là một nồng độ thuốc nano thí nghiệm (16, 32, 64, 128, 256 ppm), NT đối chứng (PGA),
1 NT thuốc Fungy Max Gold 18 EC (nồng độ 16 ppm).
Nano AgCuSiO2 + 0,06% BC (nồng độ 0,02 mL/ 100 mL môi trường) mỗi
1 NT thuốc Fungy Max Gold 18 EC (nồng độ 16 ppm)
Nano AgCuSiO2 + 1,5% BC mỗi nghiệm thức là một nồng độ thuốc nano thí nghiệm (15, 25, 35, 45, 55 ppm), và nano CuSiO2, CuNPs + 1,5% BC mỗi nghiệm thức là một nồng độ thuốc nano thí nghiệm (80, 90, 100, 110, 120 ppm), 1 NT đối chứng (PGA), 1 NT thuốc Fungy Max Gold 18 EC (nồng độ 16 ppm)
Nano AgCuSiO2 + 3% BC mỗi nghiệm thức là một nồng độ thuốc nano thí nghiệm (15, 25, 35, 45, 55 ppm) va nano CuSiO2, CuNPs+ 3% BC moi nghiệm thức là một nồng độ thuốc nano thí nghiệm (80, 90, 100, 110, 120 ppm), 1 NT đối chứng (PGA), 1 NT thuốc Fungy Max Gold 18 EC (nồng độ 16 ppm)
Phương pháp tiễn hành
Chuan bị môi trường PGA được hấp khử trùng trong nồi hấp (121°C), sau đó dé nhiệt độ giảm xuống 45 — 50°C rồi pha với thuốc theo nồng độ quy định sẵn, lắc đều rồi đồ môi trường ra đĩa petri với 10 mL/dia (ghi kí hiệu loại thuốc, nghiệm thức, lần lặp lại và ngày tiến hành thí nghiệm ở nắp đậy dia petri). Cay khoanh nam (đường kính 0,5 cm) vào trung tâm dia petri, mặt nam úp xuống tiếp xúc mặt môi trường PGA, dan kín xung quanh đĩa môi trường bằng parafin.
Chỉ tiêu theo dõi
Đường kính trung bình tan nắm: Đường kính tan nắm (tan sợi) (mm) ở một NSC đo lấy chỉ tiêu đầu tiên, các lần đo sau cách nhau 24 giờ (tùy vào từng loại nắm mà có thời gian đo khác nhau). Tiến hành đo và quan sát đặc điểm hình thái của sợi nam cho đến khi tan nam (tan sợi) phát triển chạm vào thành đĩa ở các nghiệm thức đối chứng thi
ngưng quá trình đo.
Đường kính trung bình của tan nam (tan sợi) được tinh bằng công thức:
d=(d1+d2)/2.
Trong đó: d là đường kính trung bình tản nam (tan sợi); d1,d2 là chiều dai hai đường chéo tản nam (tan sợi)
Hiệu lực hoạt chất thuốc (%) được tính bằng công thức:
H=[(D-d)/D]}x100
Trong đó: H là hiệu lực hoạt chất thuốc; D là đương kính tản nam của nghiệm thức đối chứng (mm); d là đường kính tản nắm của nghiệm thức chứa hoạt chất thuốc (mm).
2.4.3 Đánh giá tác động của vật liệu nano dén sự nảy mam bào tử nam Foc gây
hệnh héo vàng chuối già Nam Mỹ.
Phương pháp tiến hành
Dùng 20 pl môi trường PGA sau khi triệt trùng, làm nguội va phối trộn với vật liệu nano AgSi0O2, AgNPs - cts, CuSi02, CuNPs, AgCuSiO2 với các nong độ 16, 32, 64, 128, 256 ppm cho vào phan lõm của lam kính, 3 lần lặp lại mỗi lần LLL là 1 lam kính lõm. Dé yên 15 phút, tiếp tục cho 5 pl huyền phù bào tử nồng độ 10° bao tử/mL lên lam kính, đậy lam kính và ủ ở nhiệt độ phòng. Tiến hành đếm số lượng bào tử nảy mầm trong tổng số 100 bào tử dưới kính hién vi, xác định số bào tử nảy mam ở thời điểm 12 GSC và 24 GSC. Mỗi bào tử được xem là đã nảy mầm khi chiều dài ống mầm xuất hiện dài
hơn chính nó.
Dùng 20 ul môi trường PGA sau khi triệt trùng, làm nguội và phối trộn với vật liệu nano CuS1Oz, CuNPs với các nồng độ 80, 90, 100, 110, 120 ppm, AgCuS1O; với các nồng độ 15, 25, 35, 45, 55 ppm + 3% BC cho vào phần lõm của lam kính, 3 lần lặp lại mỗi lần LLL là 1 lam kính lõm. Dé yên 15 phút, tiếp tục cho 5 ul huyền phù bào tử nồng độ 10° bào tử/mL lên lam kính, đậy lam kính và ủ ở nhiệt độ phòng. Tiến hành đếm số lượng bào tử nảy mam trong tổng số 100 bào tử đưới kính hiển vi, xác định số bào tử nay mam ở thời điểm 12 GSC và 24 GSC. Mỗi bao tử được xem là đã nảy mầm khi chiều dai ống mầm xuất hiện dài hơn chính nó.
Tỷ lệ ức chế nảy mam của vật liệu nano lên bao tử nam được tính theo công thức:
Tỷ lệ ức chế (%) = [(Tổng số bào tử nảy mam ở công thức DC - tổng số bao tử nảy mam ở công thức TN)/ Tổng số bào tử nảy mam ở công thức DC] x 100.
Công thức tinh mật số bào tử :D= (4000 x ax 10*x 10")/b Trong đó:
D: số lượng bào tử/mL
2.4.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của chế phẩm sinh học đến khả năng phòng trừ bệnh héo vàng trong điều kiện nhà lưới.
Bồ trí thí nghiệm
Thí nhiệm được bồ trí hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố, gồm 5 nghiệm thức. mỗi nghiệm thức là 3 chậu, 3 lần lặp lại mỗi lần lặp lại là 1 chậu nguồn giống cây sử dụng cho thí nghiệm được lấy từ bộ môn sinh lý sinh hóa Trường Đại học Nông Lâm
TP.HCM.
NT1: Không lây nhiễm nắm (đối chứng)
NT2: Lây nhiễm nắm + phun tưới chế phẩm sinh học super cosi (nồng độ 64 ppm) NT3: Lay nhiễm nam + phun tưới chế pham sinh hoc super cosi (nồng độ 128 ppm) NT4: Lay nhiễm nam + Phun tưới chế phâm sinh học super cosi (nồng độ 256 ppm) NTS: Lấy nhiễm nam + phun tưới thuốc tilt super 300EC
Phương pháp tiến hành lây nhiễm và xử lý thuốc
Tiến hành lây nhiễm bệnh bằng phương pháp nhâm sinh khối nam trên môi trường tro trâu và hạt kê trong bình tam giác bang cách cho dịch bào tử nắm vào bình tam giác chứa hỗn hợp nhân sinh khối nam bịch kính miệng bằng bình bằng bông gòn và giấy bạc để khoảng 2 — 3 tuần đến khi hạch nắm nuôi cấy trong môi trường hạt kê xuất hiện đêm trong đều với dat đã qua hấp khử trùng ở vị trí cây tiếp xúc với nam rồi đặt cây vào chậu (Burgess và ctv 2009). Sau khi cây biểu hiện bệnh, các lá bị vàng héo rũ tiền hành cắt bỏ các lá bệnh và xử lý chế phẩm sinh học với mức nồng độ khác nhau + hoạt chất BC dạng bột, phun và tưới ướt đều các nghiệm thức.
Chỉ tiêu theo dõi: Sau 20 ngày phun thuốc theo déi đo các chỉ tiêu sinh trưởng của cây (chiều Cao cây, chiều rộng lá, đường kính thân, sỐ lá) và kiểm tra su ton tại của tế bào nam Foc ở giá thé của các nghiệm thức.
Phân lập mẫu đất khô bằng phương pháp pha loãng dung dịch đất (Burgess và ctv, 2009) được tiến hành như sau: Phơi mẫu khô, dùng cối chày nghiền dat, ray dat và trộn đều, cho 10g mau đất vào bình tam giác chứa 90 ml nước cat đã hấp khử trùng
tạo dung dich 1:10, sau đó đặt trên máy lắc lắc trong vòng 10 phút. Dé yên cho đến khi đất lắng xuống, tiếp tục hút Iml dung dich sang ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng tạo dung dịch 1:100 và lắc đều, tiếp tục hút 1 ml dung dich trong ống nghiệm thứ 2 sang ống nghiệm thứ 3 có chưa 9 ml nước cất dé có được dung dịch 1:1000, hút Iml dung dịch trong ống thứ 3 có chứa 9 ml nước cat vô trùng sang ống thứ 4 dé có được dung dịch 1:1000. Chang đều 50 ml dung dịch tương ứng các nồng độ 107, 102, 103, 10 lên trên bề mặt môi trường PGA trong đĩa peptri, để các dia trong điều kiện phòng trong 2 - 3 ngày dé các tan nam phát triển. Tiến hành cấy truyền các tản nam trên môi trường PGA và xác định nam Fusarium oxysporum bằng cách quan sát đặc điểm hình thái trên môi trường PGA và quan sát bào tử đưới kính hién vi.
2.5 Xử lý số liệu
Các số liệu thu thập được tính toán bằng phần mềm Microsoft Excel 2019 Phân tích ANOVA và trắc nghiệm phân hạng bằng phần mềm SAS 9.1
Chương 3