2.1 Nội dung nghiên cứu
Phân lập, định danh nam Chaetomium spp. tu dat trong rau hữu co tai các tỉnh Lâm Đồng, Tây Ninh, Bình Dương, Thành phố Hồ Chí Minh dựa vào đặc điểm hình
thái.
Xác định kha năng đối kháng của nam Chaetomium spp. đối với nam Colletotrichum spp. trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới.
2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 05 năm 2023 đến tháng 11
năm 2023.
Các thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Bệnh cây và nhà lưới thuộc Bộ môn Bảo vệ Thực vật khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
2.3 Vật liệu nghiên cứu
2.3.1 Môi trường dùng trong nghiên cứu:
Môi trường WA (water agar): 20 g agar, 1000 ml nước cat.
Môi trường PDA (Potato-Dextrose-Agar): 200 g khoai tây, 20 g Dextrose, 20 g
agar, 1000 ml nước cất.
2.3.2 Đối tượng nghiên cứu
Nam Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum scovillei được cung cấp
bởi phòng thi nghiệm Bộ môn Bảo vệ Thực vật, khoa Nông học, Trường Dai học Nông
Lâm Thành phó Hồ Chi Minh.
Hình 2.1 Mẫu nam Colletotrichum gloeosporioides chủng BR03 Mặt trên (A)
Mặt dưới (B)
Hình 2.2 Mẫu nam Colletotrichum scovillei chủng LD06 Mặt trên (A)
Mặt dưới (B)
Nam Chaetomium spp. được phân lập tại các vườn trồng rau hữu cơ ở các tỉnh Bình Dương, Lâm Đồng, Tây Ninh, Thành phố Hồ Chí Minh.
Giống ớt: Chánh Phong.
2.3.3 Dụng cụ, thiết bị máy móc
Cân điện tử (PX224, Ohaus, Mỹ), bếp điện, kính hiển vi (CX23, Olympus, Japan), dụng cụ cấy, đĩa petri (đường kính 80 mm), nồi hap khử trùng (MC40L, ALP, Japan) tủ cay khử trùng (2AC2 — 6E8, Esco, Singapore), tủ say khử trùng (MC40L,
ALP, Japan), tủ định ôn, thước đo.
2.4 Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Phân lập và định danh nắm Chaetomium spp.
Phương pháp thu mẫu:
Các mẫu đất được thu thập ở độ sâu tầng đất từ 15 — 30 cm. Các mẫu đất được thu thập tại tinh Lâm Đồng, Tây Ninh, Bình Dương, Thành phố Hồ Chí Minh. Lay mẫu dat ở 4 vị trí khác nhau (200 g/vị trí) xung quanh vườn, sau đó trộn lẫn vào nhau và lay mẫu đại diện (200 g/vườn thu mẫu). Mẫu đất nên được giữ trong túi nilon và viết tên nhãn cho từng mẫu (Roger và Dean, 2005).
Quy ước đặt tên mẫu: được mã hóa theo địa điểm thu thập (xã). Ví dụ: mẫu đất
thu thập thứ 1 của xã Xuân Thọ (XT01). Sau đó nắm Chaetomium spp. phân lập từ dat được quy ước đặt tên mẫu: Nơi lấy mẫu (xã), thứ tự phân lập được trong mẫu đất. Ví dụ: mẫu Chaetomium phân lập từ mẫu đất tại ruộng rau của xã Xuân Thọ (XT01).
Bảng 2.1 Mẫu đất thu thập trên các ruộng rau
STT Tênmẫu Địa điểm thu mẫu Tọa độ
1 XTOl Xuân Thọ, Đà Lat, Lâm Đồng 11°56'36.3"N 108°31'05.5"E 5 XT02 Xuân Thọ, Đà Lạt, Lâm Đồng 11°56'39.5"N 108°31'00.6"E 3 XT03 Xuân Thọ, Đà Lạt, Lâm Đồng 11°56'43.0"N 108°30'42.1"E
4 PSO1 Phước Sang, Phú Giáo, Bình 11°21'19.8"N 106°45'47.8"E Dương
5 PS02 Phước Sang, Phú Giáo, Bình 11°21'41.0"N 106°45'18.8"E Dương
6 PS03 Phước Sang, Phú Giáo, Bình 11°21'56.4"N 106°45'01.1"E Dương
7 TTHO1 Tân Thông Hội, Củ Chi, Thanh phố 10°55'18.8"N 106°29'42.8"E Hồ Chí Minh
8 TTH02 Tan Thông Hội Củ Chi Thanh phé 10°55'38.8"N 106°29'29.1"E H6 Chi Minh
9 TTIH03 Tan Thông Hội Củ Chi, Thanh phé 10°56'06.3"N 106°29'35.4"E H6 Chi Minh
10 LM0I Long My, Long Thanh Bắc, Tây 11°17'25.5"N 106°08'31.6"E
Ninh
II LMo2 Long Mỹ, Long Thành Bắc, Tây 11°17'25.3"N 106°08'23.6"E
Ninh
12 LM03 Long Mỹ, Long Thành Bắc, Tây 11°17'37.1"N 106°08'28.5"E
Ninh
Ghi chú: Tên mâu: Dat — Xã lay máu — Số thứ tự. Vi dụ: Mau dat số 1 thu tại Xuân Thọ (ĐXT01).
Phương pháp phân lập:
Nắm được phân lập từ đất bằng kĩ thuật đặt bẫy giấy lọc. Các mẫu đất được phơi khô và nghiền nhỏ, sau đó đất nghiền được cho vào dia petri đường kính 8 cm với lượng khoảng 2/3 đĩa. Các mảnh giấy lọc vô trùng, kích thước 1 x 1 cm được đặt trên bề mặt
đất trong đĩa petri. Cho vào 10 ml nước cất mỗi đĩa dé giữ 4m sau đó các đĩa đất được ủ trong tủ định ôn ở điều kiện 28°C và hàng ngày kiểm tra sự hình thành quả thé trên bay giấy. Khi qua thé xuất hiện thì chuyển lên môi trường WA có bổ sung kháng sinh ampicillin (100 mg/l) va streptomycin (100 mg/l), sau đó, tiếp tục cấy truyền lên môi trường PDA dé làm thuần.
Nam thuộc chi Chaetomium spp. được phân loại đựa vào đặc điểm hình thái theo khóa phân loại của Soytong và Quinio (1989): tất cả các mẫu phân lập (MPL) được nuôi cấy trên môi trường PDA trong điều kiện 12 giờ sáng — 12 giờ tối, sau 14 ngày nuôi cấy
ghi nhận các đặc điểm về tan nâm, quả thé va bào tử theo hình dạng va màu sac.
2.4.2 Phương pháp đánh giá tính đối kháng của nam Chaetomium spp. với nam Colletotrichum spp. trong điều kiện phòng thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố gồm 16 nghiệm thức, tương ứng với 15 dòng Chaetomium phân lập được và 1 đối chứng với 3 lần lặp lai, mỗi lần lặp lại gồm 1 dia petri. Nghiệm thức đối chứng là nắm Colletotrichum spp.
được nuôi trong đĩa petri chứa môi trường PDA. Các thí nghiệm đánh giá khả năng đối kháng được tiến hành theo phương pháp của Soytong (1988).
Phương pháp thực hiện
Chuẩn bị nguồn nam: nam Chaetomium, nam Colletotrichum gloeosporioides và nam Colletotrichum scovillei được nuôi cay trên môi trường PDA 7 ngày sau đó tiến hành thí nghiệm theo phương pháp cấy kép.
Tiến hành cấy đối xứng 2 loại nam Chaetomium spp. và nam gây bệnh trên bề
mặt môi trường trong dia petri 8 cm. Dùng khoan thạch hình trụ có đường kính 5 mm,
vô trùng, khoan lay một phan thạch 6 ria tản nắm Chaetomium sp. và đặt vào đĩa petri
(đường kính 8 cm) chứa môi trường PDA, khoảng cách đặt khoanh thạch và mép đĩa là
1,5 cm. Sau 3 ngày nuôi cấy tiến hành cấy khoanh tản sợi nam bệnh đối xứng vao trong dia petri. U đĩa ở nhiệt độ từ 28 — 30°C.
Chi tiêu theo dõi:
- Do bán kính trung bình theo công thức theo Nguyễn Thi Thuan va ctv (1996):
Trong đó:
r: Bán kính trung bình của tản nắm;
r¡: Bán kính do từ tâm tan nam bệnh về phía vị trí cay nam đối kháng (đo ở chính
giữa, mặt dưới dia petri);
ra: Bán kính đo từ tâm tản nam bệnh đến tản nắm dai nhất phân bồ theo hướng nam đối kháng (đo ở mặt dưới đĩa petri).
- Hiệu suất đối kháng PIRG (Percent Inhibition of Radical Growth) theo thang
đánh giá của Soytong (1988)
PIRG= (RI- R2)/R1 x 100.
Trong đó:
- R1 là bán kính tản nam gây bệnh cấy đối chứng;
- R2 là bán kính tản nam gây bệnh khi cấy với nam đối kháng.
Hoạt tính đối kháng quy ước như sau:
- _ Hoạt tính rất cao (PIRG > 75%);
- _ Hoạt tính đối kháng cao (PIRG: 61 — 74%);
- Hoạt tính đối kháng trung bình (PIRG: 50 — 60%);
- Hoat tính đối kháng kém (PIRG: 20 — 49%);
- Khong có khả năng đối kháng (PIRG:< 20%).
2.4.3 Đánh giá khả năng đối kháng của nắm Chaetomium spp. với nam Colletotrichum scovillei trong điều kiện nhà lưới
Sau khi đánh giá khả năng đối kháng của nam Caefomiưm spp. với nam Colletotrichum scovillei trong điều kiện phòng thí nghiệm chọn ra hai dòng nam Chaetomium có hoạt tính đối kháng mạnh nhất với nam C. scovillei để thực hiện nội dung này, do nam Colletotrichum scovillei là một trong ba tác nhân gây bệnh chính trên
ớt và có độc tinh cao nhat.
Chuan bị cây ớt khỏe:
Giá thé trồng ớt được phối trộn theo tỉ lệ 2 đất: 2 phân bò: 1 xơ dừa theo thành phần khối lượng. Ngoài ra, cần phun thuốc phòng trừ bọ trĩ và nhện ở giai đoạn cây con, thường xuyên chăm sóc cây dé cây không bị thiếu dinh dưỡng, thiếu nước, cây bị còi
cọc.
Tiến hành thí nghiệm:
Chuẩn bị nắm Colletotrichum scovillei, và hai dòng nam Chaefomium spp. đôi kháng mạnh nhất với nắm Colletotrichum scovillei trong phòng thí nghiệm được nuôi cấy trên môi trường PDA khoảng 14 ngày.
Tiến hành lây nhiễm và xử lý chế phẩm
Pha dich bao tử: cho 5 mL nước cat đã thanh trùng vào đĩa petri có chứa nam (đã hình thành bảo tử) nuôi cấy trên môi trường PDA, dùng lam kính cao đi lớp sợi nam sau đó lọc lấy dich huyền phù bao tử điều chỉnh mật số bào tử đến nồng độ 10° bào tử/mL bằng buồng đếm hồng cầu.
Công thức tính số bào tử
A =(400 xax 10 x 10")/b
Trong đó:
a: Số lượng bào tử đếm trong 16 ô lớn;
b: số ô con trong 16 ô lớn = 400 6;
n: nồng độ pha loãng của dịch bao tử;
10 : hang số.
Tiến hành xử lý:
+ Đối với NT có xử lí nam đối kháng: Phun phủ đều 20 ml dịch huyền phù bào tử nâm/chậu mật độ 10° bào tử/mL ở thời điểm 7 ngày trước khi ớt bắt đầu ra hoa (43 ngày sau trồng).
+ Đối với NT có xử lí nấm bệnh: Phun phủ đều 20 ml dịch huyền phù bào tử nắm/chậu mật độ 10° bào tử/ml cùng với 4 ml chất bám dính phun ướt đều cả cây, phun
lúc chiều tối, sau đó dùng túi nilon đen trùm tối cho cây 36 giờ ở thời điểm ớt bắt đầu ra hoa dé chủng bệnh (50 ngày sau trồng).
+ Đối với NT có xử lý chế phẩm sinh học: Pha nước cất đã thanh trùng với chế phẩm sinh học theo các nồng độ đã quy định sẵn ứng với từng nghiệm thức tưới vào chậu ở thời điểm 7 ngày trước khi ớt bắt đầu ra hoa (43 ngày sau trồng).
Bồ trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 9 NT, mỗi NT là 3 LLL, 1 LLL
của 1 NT là 10 chậu ớt
+ NTI: Nam Chaetomium PS03 và nam C. seoviilei LD06 + NT2: Nam Chaetomium LM03 và nam C. scovillei LD06
+ NT3: Nam Chaetomium PS03, LM03 và nam C. scovillei LD06 +NT4: Nam C. scovillei LD06
+ NTS: Nam Chaetomium PS03 +NT6: Nam Chaetomium LM03
+NT7: Nam Chaetomium PS03 va Nam Chaetomium LM03
+ NT8: Không xử ly
+ NT9: Chế phẩm sinh học Chaetomium BS01 và nam C. scovillei LD06
Thí nghiệm được tiến hành khi ớt bắt đầu ra hoa (khi 80% tổng số cây ra hoa trên tất cả các nghiệm thức).
Chỉ tiêu theo dõi:
Đếm số lá bệnh, quan sát phần trăm vết bệnh trên tất cả các lá của cây, có định 6 cây/nghiệm thức vào thời điểm 7, 14, 21 NSCB bằng cảm quan.
Theo đõi tỉ lệ bệnh và chỉ số bệnh ở các thời điểm 7,14 và 21 NSCB, tính hiệu quả giảm bệnh (HQGB) tại thời điểm 21 NSCB.
Công thức tính (theo QCVN 01 — 160: 2014/BNNPTNT):
HQGB = [(C - T)/C] * 100
Trong đó:
HQGB là hiệu quả giảm bệnh;
C: chỉ số bệnh ở nghiệm thức đối chứng;
T: chỉ số bệnh ở nghiệm thức có xử lý.
Ti lệ bệnh (%) = (Số lá bị bệnh/Tổng sé lá điều tra) x 100 Chỉ số bệnh (%) = (Sno + 4m; + 3ns + 2n3 +m/5N) x 100
Trong đó:
ni: số lá bị bệnh cấp 1 với < 1% diện tích lá bị bệnh, vết bệnh tròn và nhỏ;
ma: số lá bị bệnh ở cấp 3 với > 1 - 5% điện tích lá bị bệnh, vết bệnh lõm xuống;
ns: số lá bị bệnh ở cấp 5 với > 5 — 25% diện tích lá bị bệnh, vét bệnh có màu đen;
nz: số lá bị bệnh ở cấp 7 với > 25-50% diện tích lá bị bệnh, vết bệnh biến màu thối đen;
no: số lá bị bệnh ở cấp 9 với > 50% diện tích lá bị bệnh, xuất hiện nhiều vết bệnh trên lá, các vết bệnh có thé liên kết lại với nhau;
N: tổng số lá điều tra.
Chỉ tiêu sinh trưởng: Nhằm đánh giá sự ảnh hưởng của nam Chaetomium đến sinh trưởng của cây, được áp dụng theo QCVN 01-64:2011/BNNPTNT về khảo nghiệm giá trị canh tác và sử dụng của giống ớt.
+ Chiều cao cây: Do từ mặt đất đến đỉnh ngọn cao nhất, do bằng thước day;
+ Đường kính tán: Tiến hành đo khoảng cách giữa hai mép tán cách nhau xa nhất,
đo bằng thước dây.
2.5 Phương pháp xử lý số liệu
Sử dụng phần mềm Microsoft Excel dé tổng hợp số liệu, xử lý thống kê theo ANOVA (nếu có), trắc nghiệm phân hạng bằng phần mềm SAS 9.1.
Chương 3