2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tai thực hiện từ tháng 2/2023 đến tháng 8/2023.
Địa điểm thực hiện đề tài: phòng bệnh thực vật (RIBE 208) và nhà lưới thuộcViện CNSH & MT Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, vườn tại
huyện Hóc Môn (TP.HCM).
2.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Cây cà chua (Solanum lycopersicum L.)
Giống cà chua lai F1 QUEEN 104 của công ty East — West Seed
Chế phẩm nắm Mycorrhiza được hỗ trợ bởi đề tài “Nghiên cứu sản xuất nắm nội cộng sinh (Arbuscular Mycorrhiza — AM) nhằm kiểm soát tuyến trùng vả một số nam bệnh trên cây rau tại khu vực TP.HCM.”. Chủ nhiệm đề tài: TS. Trương
Phước Thiên Hoàng.
2.2.2. Thiết bị và dụng cụ
Dụng cụ: bình tia, cốc đong, đĩa petri, ray lọc có đường kính lỗ từ 40um — 50um, ỗng falcon, lam kính, lamen, micropipet, đĩa đếm chia 6, túi ziploc đựng mẫu.
Thiết bị: cân điện tử, máy khuấy từ, bếp điện, máy li tâm, kính hiển vi quang
học, kính hiên vi soi nôi.
2.2.3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Đánh giá khả năng kiểm soát nấm Fusarium solani gây bệnh trên cây cà chua của chế phẩm sinh học nam AM ở các mức liều lượng trong điều
kiện nhà lưới.
Nội dung 2: Đánh giá kha năng kiểm soát nấm Fusarium solani gây bệnh trên cây cà chua của chế phẩm sinh học nam AM ở điều kiện ngoài đồng ruộng.
2.2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.2.4.1 Đánh giá khả năng kiểm soát nam Fusarium solani gây bệnh trên cây cà chua của chế phẩm sinh học nắm AM ở các mức liều lượng trong điều kiện nhà
lưới.
Chuẩn bị chậu nhựa có kích thước 25 x 20 x 20 em, mỗi chậu chứa khoảng 4
— 5 kg đất sạch. Hạt giống cà chua được ươm trong khay ươm, đến khi cây phát triển 4 — 5 lá sau khoảng 15 — 20 ngày tuôi, chuyên cây vào chậu nhựa đã chuẩn bị sẵn trong nhà lưới.
Bồ trí thí nghiệm theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại có 5 nghiệm thức. Mỗi NT gồm 30 chậu. Được thực hiện ở
bảng 2.1. Mật số bảo tử AM có trong chế phẩm 105 bảo tử/ kg chế phẩm, gồm có 2
chi: chi Glomus và chi Acaulospora.
Bồ sung AM 2 lần, lần 1 ngay sau khi trồng, lần 2 sau 14 ngày bé sung lần 1.
Lay nhiễm nhân tạo 10 ngày sau khi b6 sung AM lần 1.
Tổng số cây thí nghiệm: 30 cây/NT x 3LLL x 5 NT = 150 cây.
Thời gian theo dõi là 7, 14, 21, 28 ngày sau xử lý lần 2.
Nguồn bệnh được lây nhiễm là Fusarium solani đã được định danh và lưu mẫu ở Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, trường Đại học Nông
Lâm TP.HCM.
Bảng 2.1. Bồ trí thí nghiệm
Nghiém thức Thành phần nghiệm thức
| NT 1 (BC âm) Cây cà chua + không nguồn bệnh + không AM
NT 2 (ĐC dương) Cây cà chua + nguồn bệnh + không AM
NT3 Cây cà chua + 2,5g chế phâm AM/kg giá thé + nguồn bệnh NT4 Cây cà chua + 5g chế pham AM/kg giá thé + nguồn bệnh NTS Cây cà chua + 10g chế phẩm AM/kg giá thé + nguồn bệnh
Liều lượng được kế thừa từ đề tài “Nghiên cứu sản xuất nắm nội cộng sinh (Arbuscular Mycorrhiza — AM) nhằm kiểm soát tuyến trùng và nắm bệnh trên cây rau tại khu vực TP.HCM.” Chủ nhiệm đề tài TS. Trương Phước Thiên Hoàng.
2.2.4.2. Lây nhiễm nhân tạo
Tiến hành lây bệnh cho cây bằng cách cho dịch bào tử lây nhiễm vào đất.
Nguồn bệnh Fusarium solani đã được định danh và lưu trữ tại phòng thí nghiệm (RIBE 208), sau 7 ngày nuôi cay dich bao tử nam sẽ được thu nhận bằng cách bố sung 10 ml nước cất vô trùng vào đĩa thạch đã cấy mam bệnh. Đếm mật độ bảo tử trong buồng đếm hồng cầu, sau đó pha loãng dịch này sau cho đạt mật độ 105 bảo tử/ml để chuẩn bị cho quá trình lây nhiễm vào cây trong thí nghiệm nhà lưới.
Tiến hành chủng nam bang cách tưới trực tiếp 8 ml dịch bảo tử/chậu (sau 10 ngày bổ sung AM lần 1). Chuẩn bị nồng độ dich bào tử: dich bào tử được đếm bằng buồng đếm hồng cầu Thomas và được tính theo công thức:
4000xax103x10”
n ( bao tử/m])
Công thức tính mật số bào tử: D =
Trong đó:
D: Mật số bao tử (bào tử/m]) a: Số lượng bảo tử trong 25 ô lớn
b: Số ô nhỏ trong 25 ô lớn.
2.2.4.3. Phương pháp theo dõi các chỉ tiêu của cay
Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm:
Số lá (lá/cây): đến số lá trên cây, đếm những lá có cuống, lá khi rụng đi vẫn để lại dấu cuống lá trên thân cây.
Chiều cao cây (cm): đo chiều dài từ gốc đến đỉnh sinh trưởng của cây.
Chiều dài rễ (cm): đo từ gốc đến chóp rễ dài nhất.
Số lượng rễ (rễ): đếm số rễ cấp 1 của cây
Ty lệ bệnh, chi số bệnh (%), hiệu lực phòng trừ
Mật số nắm AM trong 100g đất (bào tử), tỷ lệ cộng sinh nam AM trong rễ
cây (%).
2.2.4.4. Xác định tỉ lệ rễ cây bệnh và chỉ số bệnh
Quan sát rễ có biéu hiện của bệnh thối rễ: rễ chuyên màu nâu, có triệu chứng tuột cô rễ. Ty lệ bệnh được dựa theo QCVN 01-172:2014 và thang do phân cấp của rễ bị hại BVTV:
Tỷ lệ rễ bệnh (%) = (Số rễ bệnh / Tổng số rễ) x 100
Quan sát và đo chiều dài các vết bệnh trên đoạn rễ biểu hiện của bệnh thối rễ.
Chỉ số bệnh sẽ được tính theo công thức sau:
Chỉ số bệnh (%) =2@ x 100
NxT
Trong đó: a: số lượng rễ bệnh b: trị số của mỗi cấp tương ứng
N: trị số bệnh cao nhất trong bảng phân cấp T: tổng số rễ điều tra trên 1 cây
Cấp 0: không có rễ bệnh Cấp 1: 1 — 25% rễ bệnh Cấp 2 > 25 — 50% rễ bệnh
Cấp 3 > 51 — 75% rễ bệnh Cấp 4 > 76 — 100% rễ bệnh
2.2.4.5. Phương pháp tách bào tử AM
Thu bào tử nắm cộng sinh từ trong đất theo kỹ thuật sàng ướt (wet sieving) kết hợp với phương pháp ly tâm trong dung dich sucrose 50% (Brundrett, 1996):
Bước 1: Loại bỏ các hạt đá to và rác thô trong mẫu đất sau đó cân 50g dat, sau đó cho vào cốc cho 500ml nước, khuấy đều và dé lắng trong khoảng 30 phút.
Bước 2: Khuấy đều dung dich đất rồi dé yên khoảng 1 phút cho các thành phần đất to lắng xuống, sau đó lọc dung dịch đất qua rây lọc có kích thước lỗ rây lần lượt là 500 pm và 40 wm, rửa dưới vòi nước cho đến khi nước đi qua ray không còn màu đục. Bao tử nam sẽ được giữ lại trên ray lọc có kích thước lỗ 40m.
Bước 3: Thu phan đất trên sang 40 um cho vào khoảng 1/3 ống falcon thé tích 50 ml, sau đó thêm 2/3 dung dich sucrose 50% lac déu.
Bước 4: Tiến hành ly tâm với tóc độ là 2000 vòng/phút trong 5 phút.
Bước 5: Sau ly tâm, tiến hành thu phần dịch nổi, bào tử nắm nằm trong dung dịch đường sucrose. Lọc qua lỗ ray có kích thước 40 wm và rửa lại bằng nước loại bỉ hết phần đường sucrose.
Bước 6: Thu lại bào tử trên rây, sau đó đem quan sát và đếm mật số bào tử dưới kính soi nồi.
Quan sát tiêu bản bao tử nấm nội cộng sinh rễ. Bào tử nam AM sau khi ly tâm được nhuộm qua thuốc nhuộm PVLG + Melzer khoảng 5 phút. Quan sát và ghi nhận lại cấu trúc và các chi nắm AM dưới kính hiển vi. Các tiêu bản được quan sat dưới kính hiển vi quang học ở vật kính 40X và mô tả kích thước, màu sắc, hình
dạng, số lớp của thành bào tử, hình đạng cuống bảo tử (nếu có) của bào tử AM dựa
vào các mô tả của Brundrett và cộng sự (1996).
2.2.4.6. Phương pháp nhận diện nam AM cộng sinh trong rễ
Sự hiện điện của nắm AM trong rễ có thé được nhận diện bằng cách tiến hành nhuộm mẫu rễ theo phương pháp của Philips và Haymam (1970). Rễ sau khi thu về được rửa sạch đưới vòi nước dé loại bỏ dat.
Bước 1: Cắt rễ ra thành từng đoạn nhỏ dai lem. Sau đó ngâm qua dung dich
KOH (10%) khoảng 35 phút ở nhiệt độ 800C.
Bước 2: Rửa sạch mẫu rễ với nước đến khi hết màu nâu rồi tiếp túc ngâm mẫu rễ với HCl (2%) khoảng 15 phút dé trung hòa KOH.
Bước 3: Rửa mẫu rễ lại với nước rồi nhuộm mẫu rễ với Trypan blue (0,05%) khoảng 20 phút ở nhiệt độ 800C.
Bước 4: Rửa mẫu rễ nhiều lần với nước sau đó quan sát và ghi nhận cấu trúc xâm nhiễm dưới kính hiển vi ở vật kính 40X.
Ti lệ nhiễm nam cộng sinh (%) = (Tổng số đoạn rễ hiện diện AM / Tổng số đoạn rễ quan sát) x 100.
2.2.4.7. Đánh giá khả năng kiểm soát nam Fusarium solani gay bệnh trên cây cà chua của chế phẩm sinh học có AM ở điều kiện ngoài đồng ruộng
Từ kết quả của nội dung thí nghiệm trong nhà lưới chọn ra được mức liều lượng thích hợp dé tiến hành bố trí thí nghiệm ngoài đồng ruộng. Bồ trí thí nghiệm theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tổ với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại gồm 4 NT. Mỗi NT được bố trí 2 líp, mỗi líp 40 chậu (80 chậu/ NT).
Tổng số cây thí nghiệm: 80 cây/NT x 3LLL x 4NT = 960 cây.
Bảng 2.2. Nghiêm thức và thời điểm xử lý của từng nghiệm thức
Nghiệm thức Thời điểm xử lý NTI: Chế phâm nam rễ sinh học cộng sinh
AM thị trường ` ơ
, Lân 1 sau khi trông cây (Viện thô nhưỡng nông hoá, Bộ nông nghiệp : :
13 : Lân 2 sau lan 1 7 ngày và phát triên nông thôn; Mật độ đâu vào của
sân phẩm > 100 bào tử g/ chế pham)
NT2: EDDY 72 WP ( hoạt chất: Cuprous a
; ; Sau khi trông 14 ngày oxide; Dimethomorph)
NT3: Chế phâm sinh học AM thử nghiệm. ` oy
: x . Lan 1 sau khi trong cây
(Mật độ dau vào của chê phâm thử nghiệm là
5 eG Lan 2 sau lan 1 7 ngay 10° bào tử /kg ché pham)
NT4: Đối chứng (DC dương)
Bang 2.3. Sơ đồ bồ trí thí nghiệm đồng ruộng.
LLLI LLL2 LLL3
NT1 | NT2 | NT3 |) NT4 | NT2 | NT4 | NTI | NT3 | NT1 | NT4 | NT3 | NT2
Chiêu biên thiên độ doc của vườn thí nghiệm
Chỉ tiêu theo dõi:
- Chỉ tiêu nông học: chiều cao cây, số lá (số lá cấp 1), số rễ (số rễ cấp 1), chiều
đài ré, sinh khôi ré.
- Chỉ tiêu bệnh: tỷ lệ bệnh/chỉ số bệnh ở rễ
- Chi tiêu về nấm nội cộng sinh (AMF): mật số bào tử nam AM (100g đất); tỷ lệ cộng sinh của nấm AM (trên 100 đọan rễ quan sát).
Hiệu lực thuốc (%)
s Đối với nắm bệnh: Hiệu lực thuốc được tinh theo công thức Abbott
E (%) = (1-Ta/Ca) “100
Trong đó: E: hiệu lực thuốc khảo nghiệm;
Ca: Chỉ số bệnh ở công thức đối chứng tại thời điểm điều tra sau xử lý thuốc.
Ta: Chỉ số bệnh ở công thức xử lý thuốc tại thời điểm điều tra sau xử lý thuốc.
2.2.4.8. Phương pháp xử lý số liệu
Các thông tin và số liệu thu thập được tính toán bằng phần mềm Microsoft
Excel 2016.
Phân tích ANOVA và trắc nghiệm phân hang bang phần mềm SAS 9.1
Chương 3