DANH SÁCH CÁC HÌNH
CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 02 đến tháng 06 năm 2023.
Mẫu đất và rễ được thu tại các vườn bưởi đang kinh doanh 2 tỉnh Bến Tre và Tiền
Giang.
Địa điểm nghiên cứu: Phòng Vi sinh ứng dụng (Ribe 202) và khu nhà lưới — Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường — Trường Dai học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Vật liệu nghiên cứu
Nam AM được phân lập từ các vườn bưởi đang kinh doanh tại 2 tỉnh Bến Tre và Tiền Giang
Các dụng cụ sử dụng trong quá trình nghiên cứu bao gồm: bộ rây với các mắc rây kích thước: 100 um, 40 um; bình định mức 1000 ml, ống falcon, micropipette, ống eppendorf, bình tia và một số dụng cụ cần thiết khá. Các thiết bi được sử dụng: kính soi nồi, kính hién vi, máy li tâm, máy khuấy từ, cân điện tử, tủ lạnh, máy đo pH.
Hóa chất cần dùng trong nghiên cứu bao gồm: dung dịch KOH 10%, HCL 2%,
trypan blue 0,05%, PVLG và melzer (dung dịch Polyvinyl - Lactose - Glycergol va
thuốc nhuộm Melzer tỷ lệ 1:1), thuốc nhuộm 2,5 — diphenyl - 2N - tetrazolium bromide
(MTT), đường sucrose 50%.
3.2.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.2.1. Thu mẫu và phân lập nam rễ nội cộng sinh tại 2 tỉnh Bến Tre và Tiền Giang (tổng số mẫu rễ và đất 40 mẫu/tỉnh)
Phương pháp thu mẫu
Mẫu đất và rễ được thu nhập ở các vườn bưởi đang kinh doanh tại huyện Châu Thành, tỉnh Bến Tre và huyện Cái Bè, tỉnh Tiền Giang. Tổng số mẫu đất và rễ thu thập là 40 mẫu/tỉnh.
Vườn bưởi được chọn ngẫu nhiên với độ tuôi từ 3 - 12 năm và không có sử dụng chế phẩm nắm rễ nội cộng sinh. Mỗi vườn sẽ chọn ngẫu nhiên 3 cây có cùng độ tuổi.
Tại mỗi cây, chon vị trí xung quanh gốc được tính từ mép tán lá chiếu xuống. Loại bỏ 3
12
em lớp đất bề mặt, sau đó lấy khoảng 50 g rễ và 500 g dat/ vị tri với độ sâu giới hạn từ 0 - 20 em. Các mau dat được trộn đều, sau đó thu lại 50 g rễ và 1000 g - 2000 g đất/vườn.
Phương pháp thu bào tử
Bào tử AM được tách theo kỹ thuật sàng ướt kết hợp với ly tâm trong dung dịch sucrose 50% của Brundrett và ctv (1996) (có cải tiến):
Bước 1: Cân 50 g đất hòa tan trong 1000 ml nước và khuấy đều khoảng 30 phút sau đó đề yên khoảng 1 phút. Tiến hành gan dịch qua ray có kích thước lần lượt là 1000 um và 40 um. Thu phần dung dịch đất và bào tử trên ray 40 um (30 ml) cho vào các ống ly tâm có thé tích 50 ml, thêm 20 ml dung dich sucrose 50%.
Bước 2: Ly tâm với tốc độ 2000 vòng/5phút.
Bước 3: Sau quá trình ly tâm, bào tử nắm nam trong dung dịch huyền phù sucrose.
Hút dich nổi sau khi ly tâm cho qua ray 40 um và tiễn hành rửa dưới vòi nước sạch.
Bước 4: Thu lại phần đất và bào tử đem quan sát và đếm số lượng bào tử trên đĩa đếm có chia ô dưới kính soi nồi.
Phương pháp nhuộm rễ
Mau rễ sau khi thu thập sẽ được rửa sạch đất sau đó bảo quản trong tủ mát ở 49C cho đến khi sử dụng cho quá trình nhuộm. Tiến hành nhuộm rễ theo phương pháp của Phillips và Hayman (1970) (có cải tiến):
Bước 1: Rễ BDX được cắt ngẫu nhiên thành những đoạn ngắn (khoảng 300 đoạn) có độ dai khoảng 1 cm, sau đó tiến hành cắt thành từng lát mỏng. Sau đó ngâm trong dung dich KOH (10%) khoảng 30 phút ở 80°C.
Bước 2: Rửa sạch KOH với nước rồi tiếp tục ngâm rễ với HzO› kiềm trong 15
phút.
Bước 3: Rửa sạch H2O2 với nước tiếp tục ngâm mẫu rễ trong HCl 2% trong 10
phút.
Bước 4: Tiến hành nhuộm với Trypan blue 0,05% trong 15 phút ở 800C.
Bước 5: Rửa mẫu rễ nhiều lần với nước máy sau đó quan sát và ghi nhận cấu trúc xâm nhiễm dưới kính hiển vi.
13
3.2.2.2. Định danh bào tử và các cấu trúc cộng sinh của nắm AM trong đất và rễ cây bưởi
Phương pháp định danh dựa vào đặc điểm hình thái của túi, bụi và dạng sợi nắm AM nội cộng sinh trong rễ BDX
Mau ré sau khi nhuộm với Tryphan blue 0,05% sẽ chuyển sang màu xanh. Sau đó loại bỏ dung dịch nhuộm, tiến hành quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X và định danh dựa vào đặc điềm hình thái của túi, bụi và sợi nam AM nội cộng sinh trong rễ BDX
theo mô tả của Brundrett và ctv (1996).
4) if Epidermis Ĩ [ Les
Cortex
LÍ Í sms 1
©
f T Y Y a ¢
Hình 2. Các kiểu cộng sinh của AM trong rễ cây BDX. (a) Chi Glomus; (b) Chi Gigaspora và Scutellospra; (c) Glomus; (d) Chỉ Acaulospora. Nguồn Brudrett và ctv
(1996).
Phuong pháp định danh bao tw dựa vào hình thái
Nhuộm bao tử bằng cách nhỏ | giọt dung dịch PVLG + Melzer (tỷ lệ 1:1) lên lam kính cho bào tử cần quan sát vào dịch nhuộm có sẵn trên lam kính, để khoảng 5 phút cho khô bề mặt. Sau đó, đậy lamen lên giọt dung dịch có chứa bào tử nam AM.
Tiến hành quan sát hình dạng, kích thước màu sắc, số lớp của thành bào tử và hình dạng cuốn bào tử bằng kính hiền vi ở vật kính 40X và định danh theo Brundrett và ctv (1996), kết hợp với các mô tả của tạp chí quốc tế INVAM.
Phương pháp đo pH mẫu dat theo TCVN 5979: 2007 (ISO 10390: 2005)
Cân 40 g đất đã xử lý chính xác đến 0,0001 g cho vào bình thủy tinh 500 ml, cho thêm 400 ml nước cat, dùng đũa thủy tinh khuấy đều và dùng máy lắc trong 60 phút.
14
Sau đó đề lắng trong 60 phút và bắt đầu đo bằng máy đo pH đã được hiệu chỉnh trong dung dich chuẩn, chờ đến khi số trên máy 6n định thì ghi nhận kết quả.
3.2.2.3. Đánh giá khả năng cộng sinh lại trên cay Bưởi da xanh của các
nhóm tuổi nam AM Chuẩn bị
Nguồn nam AM: Từ các mẫu dat thu được ở các vườn tại huyện Châu Thành. tỉnh Bến Tre và huyện Cái Bè, tỉnh Tiền Giang. Sau đó chia các mẫu đất theo từng nhóm tuổi: nhóm AM 1 (bào tử nắm lấy từ nhóm cây 3 - 5 năm tuổi), nhóm AM 2 (bào tử nắm lay tué nhóm cây 6 - 8 năm tuổi), nhóm AM 3 (bào tử nam lay từ nhóm cây 9 - 12 năm tuổi).
Chuẩn bị cây trồng: Giống BDX được lấy tại huyện Châu Thành, tỉnh Bến Tre.
Bồ trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bồ trí theo kiêu đơn yếu tô hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 4 nghiệm thức, 3 lần lặp lại, mỗi nghiệp thức 30 cây với mật số bảo tử chúng là 1000 bào tử/chậu.
NTI: Không chủng bào tử nam AM NT2: Chung bao tử của nhóm nam AM 1 NT3: Chung bao tử của nhóm nam AM 2 NT4: Chung bao tử của nhóm nam AM 3
Thí nghiệm được bồ trí trong nhà lưới, nước được tưới vào mỗi buổi sáng. Cay
được bón phân NPK (20 — 20 - 15) với hàm lượng được pha loãng (2%) tưới theo định
kỳ 15 ngày/ 1 lần.
Các chỉ tiêu theo dõi
Tiến hành theo dõi các chỉ tiêu ở các thời điểm 60, 75, và 90 ngày sau khi chủng bào tử nắm AM, lấy chỉ tiêu bằng cách lấy triệt tiêu cho mỗi lần theo dõi. Mỗi lần theo
dõi là 2 cây/1 ô cơ sở.
Chỉ tiêu sinh trưởng: Chiều cao cây (cm), chiều dài rễ (cm), khối lượng tế tươi (6), số rễ (rễ), số chdi (chồi).
Cách xác định các chỉ tiêu: Chiều cao cây, chiều dài rễ, khối lượng rễ tươi, số rễ và số chồi. Chiều cao cây được tính từ đoạn nối giữa thân với rễ cây. Số rễ được đếm
toàn bộ sô lượng ré cap 1 có chiêu dài lớn hơn 5 cm. Chiêu dài ré được đo băng cách
15
trải dài rễ ra và đo từ vị trí cổ rễ cho đến chóp rễ dài nhất. Khối lượng rễ được cân bằng cân điện tử có độ chính xác đến 0,0001.
Chỉ tiêu nắm AM
Mật số bào tử trong đất: Bào tử được từ các mẫu đất sẽ được phân tách bằng kỹ thuật sàng ướt kết hợp ly tâm với dung dịch sucrose và đếm mật số bào tử.
Tỷ lệ cộng sinh trong rễ: Quan sát 100 đoạn rễ ngẫu nhiên dưới kính hiển vi 40x và ghi nhận tỷ lệ cộng sinh nắm AM theo công thức:
3 số lát rễ có xuất hiện NCS AM
TLCS (%) = _— : x 100
> số lát rễ quan sát
3.3. Xử lý số liệu
Số liệu được xử lý và chuyên đổi bằng phần mềm Excel, sau đó xử lý thống kê bằng phương pháp ANOVA và trắc nghiệm phân hạng bằng phần mềm Minitap 19.
16