3.1. Thời gian và địa điểm
nghệ Việt Nam.
3.2. Đối tượng nghiên cứu
3.2.1. Nguyên liệu hóa chất và tế bào Bảng 3.1. Nguyên liệu và hóa chất
Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 3/2023 đến tháng 6/2023
Địa điểm thực hiện đề tài: Phòng Sinh Dược - Viện Hàn lâm Khoa học và Công
STT Tên nguyên liệu hóa chất Xuất xứ Mục đích sử dụng : Sodium alginate (Alg, Mn ~ 120,000- Fisher Nguyên liệu tông
190,000 g/mol) Scientific hop
: Pluronic F127 (F127, Mn~ 12600 Sigma- Aldrich Nguyên liệu tổng
g/mol) (USA) hop
1-(3-Dimethylaminopropy]l)-3- ; Nguyên liệu tổng
3 Acros Organics
ethylcarbodiimide (EDC, >97%) hop
ơ ; Nguyờn liệu tụng
4 N-Hydroxysuccinimide (NHS,>98%) Acros Organics 1 op
ơ af Nguyờn liệu tong
5 Khí nito tinh khiết phân tích Việt Nam
hợp
‘ Nguyên liệu tổn
6 Nước cât Việt Nam ad =
hop
p-nitrophenylchloroformate (p- NPC, ; Nguyên liệu tổng
# Acros Organics
>97%) hợp
Cystamine dihydrochloride (Cys, ; Nguyên liệu tổng
8 Acros Organics
297%) hop Toronto
9 Methotrexate Research Dược chat thử
; nghiém Chemical
23
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
TNBS
Dimethyl sulfoxide
Natri bicarbonate
Acid hydrochloric
Natri hydroxide
0,25% Trypsin-EDTA 1X
Trypan blue
(ab235935)
Thuốc nhuộm Acridine orange/
Propidium iodide (AO/P])
Lipopolysaccharid (LPS) Bộ kit Sulforhodamine B (SRB)
Griess reagent (modified) (G4410)
Sigma- Aldrich Fisher Scientific
Hoa Ky
Gibco
Sigma- Aldrich
Abcam
Life Technologies
Korea LLC Sigma- Aldrich
Sigma- Aldrich
Dược chat thử
nghiệm
Dung môi
Dung môi
Điều chỉnh pH Điều chỉnh pH
Nhuộm tê bào
Bảng 3.2. Các dòng tế bào thử nghiệm
STT Té bao Nha cung cap
, Trung tâm Công nghệ sinh học 1 Tê bao RAW264.7
TP.HCM, P4
2 Té bao MSC Lonza, P3
24
3.2.2. Dụng cụ và trang thiết bị Bảng 3.3. Danh mục trang thiết bị
STT Tên thiết bị Model Xuất xứ
1 May cổ quay Buchi Rotavapor Thụy Sĩ R-114
2 Bề siêu âm Elmasonic S 80H Duc
3 Máy đông khô EYELA FDU-1200 Nhật Bản 4 May li tâm lạnh Hermle Z32HK Đức
5 Cân phân tích 4 số lẻ Ko. PAAR Mỹ
PA114
6 Máy khuấy từ gia nhiệt VELP Scientifica Italy 3 Máy quang phổ tử ngoại
khả kiến
8 May sac ky long hiéu nang cao Aligent Nhat Ban
9 May do kích thước hat Horiba SZ-100 Nhat Ban
10 Máy ly tâm lạnh tốc độ cao HERMLE Z 32 HK Đức
ẩ MEMMERT INCO
11 Tủ âm CO2 246 MED Mỹ
12 Máy đọc bảng giếng tự động HumanReaderHS Duc 13 Nồi hap tiệt trùng CL-32L/ALP Nhat Ban
Ă4 Kớnh hiển vi đảo ngược 2 thị kớnh Tent 4ủ0 Mỹ
LABOMED
15 Kimhhiển N Smit VÕ HHƠN tỉ 1/8 FDU Nhật Bản
: Kính hiển vi đồng tiêu Laser Dragonfly 200 dai
ANDOR
25
Bảng 3.4. Danh mục dụng cụ
STT Tén dung cu Hang san xuat 1 Binh cầu 1 cô Duran 100 mL Viét Nam
2 Ong falcon ly tam 50mL Việt Nam
3 Micro pipet Việt Nam
4 Hu bi Viét Nam
5 Mang cellulose Spectra/Por® 12-14 kDa My
6 Ca từ, kim tiêm Viét Nam
7 Giay do pH Việt Nam 8 Binh định mức, ống dong Việt Nam
9 Chai nuôi cấy, 25 cm2 Biologix (Hoa Kỳ) 10 Dia petri nuôi cay, 35 x 10 mm Biologix (Hoa Ky) 11 Dia petri nudi cay, 90 x 20 mm Biologix (Hoa Ky)
" " ; , SPL Life Sciences (Hàn 12 Đĩa nuôi cây 96 giêng, đáy phăng, có nắp ,
Quôc)
a 2 : l SPL Life Sciences (Han 13 Dia nuôi cây 24 giêng, day phang, có nap :
Quôc)
14 Buông đếm tế bao Neubauer Marienfeld (Đức) 15 Ong ly tâm 50 ml Finetech (Đài Loan) l6 Đầu tip 1000 pl Biologix (Hoa Ky)
l Thermo Fisher Scientific 17 Dau tip 200 wl
26
(Hoa Ky)
18 Đầu tip 10 pl Biologix (Hoa Kỳ)
19 Eppendorf 2,0 ml ISOLAB (Đức)
20 Dau lọc ỉ 0,22 pm Finetech (Đài Loan)
3.2.3. Các phương pháp phân tích
Phố hồng ngoại (FT-IR)
Thiết bị FT-IR/NIR Spectroscopy Frontier được đặt tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, và sử dụng phương pháp nén viên bằng KBr dé xác định phổ hấp thụ hồng ngoại trong khoảng từ 4000 đến 500
cem^-1.
Quá trình chuẩn bị mẫu thử bao gồm nghiền 2mg mẫu thử kèm với 100 mg KBr thành bột mịn (dùng cho đo IR). Sau đó, hỗn hợp này được sấy khô và kết hợp dé tạo thành một viên nén có đường kính 13mm, nhằm đảm xbảo cường độ phô phù hợp. Việc nghiền mịn đồng nhất hỗn hợp và đảm bảo sự đều đặn của nó được thực hiện trên một khuôn thích hợp. Hỗn hợp chất thử sau đó được nén trong điều kiện chân không với áp suất khoảng 800 Mpa. Sau khi hoàn tất quá trình nén viên, tiến hành đo phổ hấp thụ hồng ngoại.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Tổng hợp copolymer nhạy nhiệt trên cơ sở alginate-cystamine và Pluronic
F127
Hệ copolymer nhạy nhiệt được tạo thành dựa trên sự kết hop của alginate- cystamine va Pluronic F127, thông qua liên kết giữa nhóm amin trên alginate-cystamine và nhóm (C=O) của hợp chất Pluronic sau khi hoạt hóa bằng p-nitrophenyl chloroformat (NPC). Quá trình tổng hợp Copolymer Alg-F127 được thực hiện bang phương pháp tổng hợp hóa học, dựa trên quy trình đã được phát triển tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng — Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Sau khi hoàn thành quá trình tổng hợp, sản phẩm được liên kết với acid folic (FA) thông qua nhóm NH2 tự do còn tôn tại. Cấu trúc cuối cùng của sản phẩm được xác định thông qua phân tích phổ FT-IR.
27
3.3.1.1. Tổng hợp dẫn xuất Aliginate-cystamine(Na-Alg-Cys)
Các nhóm amin trên mạch Natri alginate (Na-Alg) được tạo ra dé phản ứng với NPC-F127-OH, cystamine (Cys) được sử dụng để tạo ra các nhóm amin. Cystamine có cấu trúc 2 nhóm NH2, một nhóm tạo liên kết với nhóm carboxylate có trên alginate, một nhóm NH2 tự đo còn lại tạo liên kết với NPC-F127-OH.
HạN NHạ
ONa ONS gg gã
n EDC/NHS
Na-Alg Na-Alg-Cys
Hình 3.1 Sơ đồ phan ứng tổng hợp dẫn xuất Na-Alg-Cys.
Hòa tan
> Điều chinh pH
| - Nhiệt độ phòng Khua -
—T TOP |_ -t=30 phút
x
Š ƒ - Nhiệt độ phòng
>| Tao tủa et độ
ORNS | -t=24h
x
>| Hoa tan
*
| Tham tach = - Mang cellulose
x
Say thang hoa
Hình 3.2. Quy trình tổng hợp Na-Alg-Cys.
Quy trình được thực hiện như sau:
Bước 1: Cân chính xác khối lượng Sodium alginate (Alg) và hòa tan vào dung môi gồm Dimethyl sulfoxide (DMSO) và nước ở tỷ lệ 1:1 theo thé tích. Khi hỗn hợp
28
dat được sự đồng nhất, tiến hành điều chỉnh pH của dung dịch Alg về khoảng 5,5 bang
cách sử dụng dung dịch NaOH 0,1M hoặc HCI 0,1M.
Bước 2: Tiếp theo, cho N-Hydroxysuccinimide (NHS) và 1-Ethyl-3-(3-
dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) vào cùng môi trường đã hòa tan Alg và hoạt hóa trong vòng 30 phút.
Bước 3: Sau đó, hòa tan cystamine (Cys) trong nước và từ từ nhỏ giọt vào hỗn hợp dung dịch Alg/EDC/NHS đang được khuấy ở tốc độ 1000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Hỗn hợp tiếp tục được khuấy trong vòng 24 giờ.
Bước 4: Dung dịch sau phan ứng được thêm từng giọt vào cồn tuyệt đối dé thu tủa. Kết tủa sau đó được hòa tan lại trong nước và thực hiện thâm tách bằng màng cellulose (MCWO~12-14KDa) trong môi trường nước cất dé loại bỏ Cys không phan ứng, chất hoạt hóa và các dung môi đã sử dụng.
3.3.1:2. Tổng hợp NPC-F127-OH
Quy trình hoạt hóa Pluronic F127 dé tạo ra sản phẩm NPC-F127-OH đã được Trần Ngọc Quyền và đồng nghiệp báo cáo trong các tài liệu. Quá trình này được thực
hiện theo hai bước như sau:
Bước 1: Trong bước này, p-nitrophenyl chloroformate được thêm vào Pluronic F127 đã được làm nóng chảy ở 65°C, với tỷ lệ NPC:F127 là 2,5:1 theo tỷ lệ mol. Sau 6
giờ phản ứng, nhiệt độ được hạ xuống nhiệt độ phòng và hỗn hợp này được pha loãng với dung môi Tetrahydrofuran (THF). Sau đó, sản phẩm được thu được sau khi kết tủa lạnh bằng diethyl ether. Tiếp theo, dung môi được loại bỏ bằng cách cô quay bay hơi
trong chân không.
Bước 2: Trong bước này, NPC-F127-NPC được tiếp tục cho phản ứng với 3- amino-1-propanol trong THF để tạo ra sản phẩm NPC-F127-OH. Sau đó, sản phẩm NPC-F127-OH được làm sạch và tinh chế tương tự như bước 1, để đảm bao sản pham hoàn toàn tinh khiết.
29
9 on, dỗNH
P Haft HN. ^ .OH Oo NH lu
| ial a | i
100 65 100 ô=O s-S
H Fil
NPC-F127-OH Ria days
S5 HạN
NH
+ lý 0
`: HO bạ
6 4 A “a
100 65 100 2
Alg-F127
Hình 3.3. Sơ đồ tong hợp Alg-F 127.
Na — Alg — Cys
š - T lạnh
Tham tach - Mang cellulose - 7ngay
Đông khô
Hình 3.4. Quy trình tổng hợp Alg - F127.
30
Quy trình thực hiện như sau:
Bước 1: Ban đầu, Na-Alg-Cys được hòa tan trong nước cất cho đến khi đạt được sự đồng nhất. Sau đó, mẫu tiếp tục được khuấy trong môi trường lạnh, ở nhiệt độ dưới
15°C,
Bước 2: NPC- F127- OH được hòa tan trong nước cat ở nhiệt độ 4°C, và khuấy cho đến khi hoàn toàn tan. Dung dịch NPC-F127-OH sau đó được thêm vào dung dịch Na-Alg-Cys và khuấy đều. Hỗn hợp này được giữ lạnh ít nhất trong vòng 24 giờ trước khi thực hiện quá trình thâm tách bằng mang cellulose (12,000-14,000 Da).
Bước 3: Quá trình thấm tách diễn ra trong nước cất va kéo dai trong khoảng 7 ngày trước khi mẫu được đem đi đông khô.
Bước 4: Sản phẩm thu được sau quá trình đông khô được đem di đo phô hạt nhân từ hấp dẫn hạt nhân 1H-NMR đề xác định cấu trúc của sản phẩm.
3.2.1.2. Tổng hợp Alginate-cys-pluronic F127-Acid folic(Alg-F127-FA)
Hình 3.5. Sơ đồ tong hợp Alg-F127-FA
Quy trình phản ứng được thực hiện như sau:
Bước 1: 0,1g Acid folic được hòa tan hoàn toan trong 10 ml Dimethyl sulfoxide
(DMSO), sau đó điều chỉnh pH của dung dịch về khoảng 5,5. Tiếp theo, hỗn hop 1-
ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) và N-
31
hydroxysuccinimide (NHS) với tỷ lệ số mol 1:1 (0,2 mmol) được pha vào dung dịch Acid folic trên, và hoạt hóa trong vòng 30 phút, tạo thành hỗn hợp dung dịch A.
Bước 2: 1g Alg-F127 được hòa tan trong 20 ml nước cất, tạo thành dung dịch B.
Bước 3: Dung dịch A được từ từ thêm vào dung dịch B, và khuấy ở nhiệt độ
phòng trong 24 gio.
Bước 4: Sau khi kết thúc phản ứng, dung dịch được mang đi thẩm tach bang
màng cellulose (12 — 14 KDa) trong môi trường đệm Phosphate Buffered Saline (PBS)
với pH 7.4, trong vòng 3 ngày dé loại bỏ Acid folic dư. Tiếp theo, thẩm tách tiếp tục
trong môi trường nước dé loại bỏ mudi đệm dư.
Bước 5: Phan dung dịch trong túi thâm tách sau đó được đem sấy thăng hoa dé thu sản phẩm dạng bột là Alg-F127-FA.
Bước 6: Cuối cùng, sản phẩm Alg-F127-FA được đánh giá cau trúc bằng phương pháp hồng ngoại gần (FT-IR).
3.3.2. Nang hóa Methotrexate vào hệ alginate-pluronic F127-folic acid va khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ
Mẫu đo kích thước hạt bị tác động bởi nhiệt độ được chuẩn bị như sau, 10 mg mẫu Alg-F127-FA được hòa tan trong 10 ml nước cất với nhiệt độ lạnh. Sau đó, dung dịch nanogel sẽ được siêu âm trong 20 phút ở 35°C bằng bể siêu âm Elmasonic S 80H.
Mau tiếp tục được dé 6n định 8-12 giờ ở nhiệt độ phòng. Tiến hành đo kích thước tiêu phân ở 25°C và 37°C bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động (Dynamic Light Scatterineg— DLS) trên thiết bị phân tích kích thước Horiba SZ100.
3.3.2.1. Quy trình nang hóa Methotrexate vào hệ alginate-pluronic F127-folic acid
Quy trình nang hóa MTX vào hệ được thực hiện như sau:
Bước 1: Cân và hòa tan chính xác khối lượng Methotrexate (MTX - XI) trong 8
mL dung dịch Alg-F127-FA (X2).
Bước 2: Khuấy đều hỗn hợp ở tốc độ 200 vòng/phút trong 60 phút ở nhiệt độ
phòng.
Bước 3: Sau đó, dung dịch thu được được chuyên vào ống ly tâm có dung tích 15 mL và sử dụng phương pháp ly tâm dé loại bỏ MTX không tải khỏi hệ. Quá trình ly tâm được thực hiện ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 10 phút.
32
Bước 4: Phan dung dịch trước và sau ly tâm được pha loãng dé sử dụng cho đánh giá hiệu suất nanogel hóa (Y 1).
Bước 5: Phần dung dịch sau ly tâm được sử dụng dé đánh giá kích thước hạt của
hệ nanogel (Y2).
Như vậy, quy trình trên cho phép đánh giá hiệu suất nanogel hóa của hệ Alg-
F127-FA chứa MTX (Y1) cũng như kích thước hat nanogel hình thành (Y2).
3.3.2.2. Phuong pháp đánh giá hàm lượng Methotrexate giải phóng từ hệ hệ alginate-pluronic F127-folic acid
Các nghiên cứu về giải phóng in-vitro của các hạt nano cao phân tử đã được rộng rãi tiến hành thông qua phương pháp khuếch tán màng. Trong quá trình nay, 0,5 mL của chế phẩm được đặt vào một túi màng thâm tách và sau đó buộc chặt. Túi mang nay sau đó được đưa vào một dung dịch muối đệm phosphate (PBS) có pH 7,4 với thể tích là 15 mL. Dung dich được duy trì ở nhiệt độ 37 °C và liên tục khuấy đều với tốc độ 50 vòng/phút. Sau mỗi khoảng thời gian cố định trước đó, cụ thé là 1 giờ, 3 giờ, 6 giờ, 12 giờ, và 24 giờ, 0,5 mL dung dich môi trường được lấy ra thông qua màng lọc 0,22 pm.
Đồng thời, 0,5 mL dung dịch PBS được thêm vào để đảm bảo thể tích của dung dịch đệm không thay đổi. Các mẫu sau khi thâm tách được bơm vào vial dé tiêm mẫu tự động. Lượng mẫu tiêm là 20 pL và sử dụng dung môi chạy cột C18 - 18000 5.5 um.
Tốc độ bơm được thiết lập là 1 mL/phút và do tại bước sóng 303 nm. Pha động gồm có
Acetonitrile (kênh A) và nước với 1% acid fomic (kênh B). Chương trình chạy gradient
được thiết lập như sau: từ 0 đến 12 phút, kênh A tăng từ 0% lên 60%, sau đó từ 12 đến
15 phút, kênh A tăng từ 60% lên 100%. Sự giải phóng của MTX từ các hạt nano được
xác định bằng cách sử dụng phân tích đường chuẩn.
Dé xác định đường chuẩn, chúng ta đã lấy chính xác 4 mg MTX tinh khiết và hòa tan trong 10 mL dung dịch PBS có pH 7,4, tạo thành nồng độ 400 ppm. Sau đó, chúng ta đã tiến hành pha loãng dé tạo ra các dung dịch có các nồng độ từ 0 đến 28 ppm bằng cách sử dụng dung dịch đệm PBS có pH 7,4. Kết quả sau đó được đo bằng phương pháp HPLC của dung dịch MTX sau khi đi qua màng lọc 0,22 um dé xác định đường chuẩn. Từ phương trình đường chuẩn, chúng ta có thể xác định hàm lượng MTX được nạp vào hệ và nồng độ MTX được giải phóng ra từ hệ nano Alg-F127-FA.
Phần trăm thuốc MTX phóng thích được tính theo công thức:
(V, x Œ¡+ Vo #.Œ;_¡)x 100%
m
%MTX = Trong đó:
33
V là tong thé tích của dung dich PBS (15 mL)
Ci là nồng độ của thuốc trong dung dich PBS (mg/mL) V› là thé tích của mau (0,5 mL)
m là lượng thuốc MTX trong 0,5 mL chế pham (mg)
3.3.3. Khao sát tính an toàn của hệ nano MTX/Alg-F127-FA
3.3.3.1. Nuôi cấy tế bào Chuẩn bị môi trường:
Môi trường DMEM/F12: 11,8 g DMEM/F12 và 1,2 g NaHCO3 trong 1000 ml
nước cất (đã lọc và hấp tiệt trùng), pH 7.4.
Môi trường DMEM: 13,3 g DMEM va 3,7 g NaHCO3 trong 1000 ml nước cất (đã lọc và hấp tiệt trùng), pH 7.4.
Mụi trường được lọc (ỉ 0,22 wm) trước khi sử dụng. Mụi trường được bao quản
ở nhiệt độ 2°C — 8°C.Môi trường hoàn chỉnh được bồ sung 10% (v/v) FBS, 1% (v/v)
penicillin- streptomycin.
Điều kiên nuôi cấy:
MSC được nuôi trong môi trường DMEM/F12. RAW264.7 được nuôi trong môi trường DMEM.
Đĩa được ủ trong tủ CO2 ở điều kiện CO2 5%, độ âm 90% ở 37°C. Môi trường nuôi cấy được thay mỗi 48 giờ. Khi tế bào đạt đến độ hợp lưu 70 — 80%, cấy chuyền
được thực hiện.
Quy trình cay chuyền tế bào bám dinh(MSC,RAW264.7):
Môi trường cũ được loại bỏ, rửa đĩa nhẹ bằng PBS 1X (3 lần), sau đó thêm vào 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA 1X, tráng đều bề mặt đĩa nuôi và ủ ở nhiệt độ 37 °C trong 3 — 5 phút. Quan sát dưới kính hiển vi soi ngược dé đảm bảo các tế bào đã co tròn và tách ra khỏi bề mặt đĩa. Thêm vào 4 ml môi trường dé bat hoạt trypsin và trộn đều.
Chuyên huyền phù tế bao vào ống ly tâm 50 ml. Ly tâm ở 1200 rpm trong 5 phút, thu cặn tế bào. Thêm 2 ml môi trường vào và trộn đều. Sau đó, cho huyền phù tế bào vào các đĩa mới, thêm môi trường cho đủ 5 ml (đối với chai nuôi cấy 25 cm2) hoặc 10 ml (đối với dia petri 90 x 20 mm). Khảo sát giá trị ICso với dong tế bào RA W264.7 va dong tế bao MSC sau 48 giờ và 72 giờ ủ giữa MTX tự do là 120 ppm và hệ MTX/Alg — F127
—FA.