2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu:
- Thời gian nghiên cứu: Đề tài được thực hiện từ tháng 01/2018 đến tháng
05/2020
- Địa điểm nghiên cứu: tại phòng thí nghiệm của Phân viện Cơ Điện Nông Nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch, số 45 Đinh Tiên Hoàng, quận 1, Tp Hồ Chí
Minh
2.2. Đối tượng nghiên cứu:
Đối tượng nghiên cứu của đề tài là xoài phụ phâm được thu nhận từ các công ty chế biến xoài đông lạnh và xoài say gồm: thịt xoài vụn từ phan thịt hai bên má xoài, và các vụn không đạt kích thước sau khi đã lựa chọn sản phẩm chính hoặc phần thịt còn lại sau khi đã lấy đi phần thịt chế biến sản phẩm chính.
Phần thịt xoài sẽ được thu nhận, đông lạnh và chuyển đến phòng thí nghiệm, trữ lạnh đề tiến hành thí nghiệm.
2.3. Vật liệu nghiên cứu:
2.3.1. Chế phẩm Enzyme:
- Enzyme pectinase được cung cấp bởi công ty Kovin Việt Nam:
+ Dạng bột
+ Hoạt độ 60.000U/g,
- Sử dụng trong quá trình chiết xuất nước trái cây, tăng hiệu suất chiết xuất trái cây, ứng dụng trong sản xuất nước trái cây, rượu vang,
- Chế phẩm pectinex Ultra SP-L do công ty Novozyme cung cấp.
+ Chất lỏng có màu nâu, mùi lên men nhẹ, có ty trọng: 1,17 (g/ml), khoảng pH
hoạt động 4-9.
16
+ Chế phẩm enzyme có hoạt tính Polygalacturonase.
- Chế phẩm Pectinex Ultra Clear do công ty Novozyme cung cấp:
+ Chế pham ezyme hoạt tinh polygalacturonase thủy phân liên kết (1,4)-alpha-
D-galactosiduronic trong pectin và các galacturonan
+ Hoạt độ của chế phẩm enzyme là 7900 PGNU/ml.
- Chế phẩm nam men: RV 100, RV 002, BV 818 được cung cấp bởi công ty
Kovin Việt Nam
+ RV100 (Sacchromyces cerevisiae):
Nhiệt độ lên men thích hợp 10-35°C, khả năng chịu cồn < 18% (v/v), tạo glycerol 6g/1, tạo acid dé bay hơi thấp, không tạo SO2 và HS trong quá trình lên
men.
+ RV 002 (Sacchromyces cerevisiae):
Nhiệt độ lên men thích hợp 10-30°C, khả năng chịu cồn < 14% (v/v), tạo glycerol 8g/l, tạo acid dé bay hơi với lượng ít, không tao tạp chất và hình thành bọt thấp.
+ BV 818 (Saccharomyces bayanus):
Nhiệt độ lên men thích hợp 10-30°C, khả năng chịu cồn < 18% (v/v), tạo acid dé bay hơi thấp, chịu được môi trường có nồng độ SO? cao.
2.3.2. Chủng vi khuẩn Acetobacter:
Chủng vi khuẩn Acetobacter (đã được định danh bởi Phòng xét nghiệm Công ty TNHH DV và TM Nam Khoa) được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Phân viện
Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ Sau thu hoạch
+ Acetobacteria tropicalis (BT) được phân lập từ quá trình lên men hạt ca cao.
+ Acetobacteria persici (X1) được phân lập từ quá trình lên men xoài tự nhiên.
+ Acetobacteria pasteurianus (X2) phan lập từ qua trình lên men xoài tự nhiên.
+ Acetobacteria cerevisiae (X3) được phân lập từ qua trình lên men xoài tự nhiên.
+ Acetobacteria tropicalis (G1) phân lập từ giam gạo lên men truyền thống.
+ Acetobacteria senegalensis (G3) phân lập từ giấm gạo lên men truyền thống.
17
2.4. Phương pháp nghiên cứu:
2.4.1. Khảo sát và đánh giá chất lượng nguồn nguyên liệu Mục đích: nhằm xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu
Phần phụ phẩm được đóng gói bảo quản lạnh ở 5°C va chuyền đến phòng thí nghiệm dé phan tich. Thit vun duoc xay nhuyén va tién hanh phân tích các chi tiêu
Sau:
- Màu sắc
- Hàm lượng chất khô (% m/m)
- Hàm lượng đường tổng số (% m/m)
- Hàm lượng pectin (%)m/m - Hàm lượng protein (% m/m)
- Hàm lượng polyphenol tổng số (mgGA%).
2.4.2. Lựa chọn chủng nắm men và vi khuẩn acetic phù hợp với quá trình lên men giấm từ dịch xoài
2.4.2.1. Lựa chọn chủng nam men phù hợp với quá trình lên men rượu dich
xoài
Mục đích: Lựa chọn chủng nắm men lên men rượu từ dịch xoài có hiệu suất lên men cao, đánh giá cảm quan tốt: màu sắc vàng, hương thơm, mui vi xoài đặc trưng, không lẫn với mùi, vi lạ.
Ching nắm men: gồm 3 chế pham nam men thương mại do công ty Kovin cung cấp tai thị trường Việt Nam: Angel wine active dry yeast BV818, RV002, RV 100.
Dịch xoài chuẩn bị lên men: Thịt xoài vụn được xay nhuyễn pha loãng với
nước theo tỉ lệ nước/ thịt xoài là 1:2, lọc qua vải lọc thu nhận dịch xoài. Dịch xoai
được gia nhiệt lên đến 80°C dé ngăn chặn sự phat triển của vi sinh vật gây hại. Sau đó, dịch được rót vào chai và làm nguội đến nhiệt độ phòng.
Hoạt hóa chế phẩm nấm men: Chê phẩm nam men được sử dụng với liều ding 0,4g/ dich (theo khuyến cáo của nhà cung cấp) được hòa tan vào dung dịch đường glucose 10% dé yên trong 15 phút dé hoạt hóa tế bào nam men (theo hướng dan của
đơn vị cung câp). Sau đó bô sung vào dịch xoài đê tiên hành lên men.
18
Qua trình lên men: Quá trình lên men được ủ ở 30°C. Khi quá trình lên men
kết thúc thu nhận mẫu dé tiễn hành phân tích các chỉ tiêu theo dõi.
Các chỉ tiêu theo dõi:
- Hàm lượng chất rắn hòa tan (%)
- Hàm lượng đường còn lại (%) - Hàm lượng ethanol tạo thành (%)
- Đánh giá cảm quan: màu sắc, hương thơm, mùi, vị - Tính hiệu suất của quá trình lên men:
Hiệu suất lên men được tính theo công thức:
Độ cồn x 0,789 x =
H=
Hàm lượng đường ban đầu
Trong đó:
H: hiệu suất lên men rượu (%) Độ côn (% v/v)
0,789: hệ số chuyển đổi của rượu ethanol
Mỗi nghiệm thức được thực hiện 3 lần, mỗi nghiệm thức với dung tích 1000ml. Nghiệm thức được lựa chọn là nghiệm thức có hiệu suất lên men cao nhất,
dịch rượu trong, có màu vàng đặc trưng của xoài, không có mùi vi lạ,
2.4.2.2. Lựa chọn chủng vi khuẩn acetic phù hợp với quá trình lên men giấm từ
rượu xoài.
Mục dich: Lựa chọn chủng vi khuẩn acetic lên men giấm từ rượu xoài, đánh giá cảm quan tốt: màu sắc, hương thơm, mùi vị xoài đặc trưng, hiệu suất lên men cao
Ching vi khuẩn acetic: các chủng vi khuẩn được cung cấp bởi các trung tâm nghiên cứu như: Phân viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch gồm các chủng được phân lập từ giấm nuôi truyền thống, giấm trái cây, quá trình lên
men hạt ca cao.
- Acetobacteria tropicalis (BT), được phân lập từ quá trình lên men hat ca
cao.
19
- Acetobacteria persici (XI), Acetobacteria pasteurianus (X2), Acetobacteria cerevisiae (X3), được phân lập từ quá trình lên men xoài tự nhiên.
- Acetobacteria tropicalis (G1), Acetobacteria senegalensis (G3), được phan
lập từ giấm gạo lên men truyền thống.
Dịch chuẩn bị lên men: rượu xoài được lên men từ quá trình lên men rượu từ dịch xoài, dịch lên men được điều chỉnh với độ cồn là 5% (v/v).
Chuẩn bị chủng vi khuẩn: Lẫy một khuẩn lạc vi khuẩn thuần chủng cấy vào môi trường tăng sinh YPDG có bổ sung 10% dịch xoài (v/v). Nuôi cay lắc trong 2
ngày.
Quá trình lên men: Bỗ sung dich giống vào dịch lên men đạt mật độ 10’cfu/ml lắc đều và cho tiến hành lên men. Quá trình lên men xảy ra ở 30°C. Hàng ngày tiến hành thu nhận mẫu dịch lên men kiểm tra: Hàm lượng acid acetic (% m/v) tạo thành
trong dịch lên men.
Khi quá trình lên men kết thúc, các nghiệm thức được kiểm tra các chỉ tiêu:
- Hàm lượng acid tổng (% m/v theo acid acetic) - Hàm lượng chất rắn hòa tan (°Bnx)
- Hàm lượng ethanol còn lại (%v/v)
- Đánh giá cảm quan: màu sắc, hương thơm, mùi, vị - Tính hiệu suất của quá trình lên men:
Hiệu suất lên men được tính theo công thức:
llC,
Cit
Trong đó:
H: Hiệu suất của quá trình lên men giấm (%)
Ctt: Hàm lượng acid trong dịch sau lên men (% m/v)
Clt: hàm lượng aicd acetic tinh theo lượng ethanol đã sử dung (% m/v)
Mỗi mẫu lên men được thực hiện với dung tích 500ml. Mỗi nghiệm thức được thực hiện 3 lần. Nhằm lựa chọn chủng vi khuẩn acetic phù hợp với quá trình
lên giâm từ rượu xoai.
20
2.4.3. Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất giấm xoài
Xay nhuyễn
Ỳ
Xử lý nhiệt
thủy phân
Ỳ
Lọc
Dịch xoài
Lên men (25-30°C)
Ỷ
Lọc
Ỳ /\
> Ba xo
| Phối chế
Lên men giâm
Ỷ
Thu dịch, lão hóa, đóng chai, thanh
Giâm xoài
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình sản xuất giam xoài
21
> Ba men
Giải thích quy trình:
- Xay nhuyễn: biên đổi quan trọng của quá trình nhất trong quá trình này là kích thước nguyên liệu giảm, diện tích bề mặt riêng sẽ tăng lên, làm tăng hiệu quả của quá trình truyền nhiệt, truyền khối bên cạnh đó sẽ làm cho phản ứng enzyme được xúc tác một cách dễ dàng hơn. Tuy nhiên, nếu kích thước các hạt vật liệu được xay quá nhỏ, khi trích ly vật liệu không đủ xốp làm dung môi và nhiệt tiếp xúc nên dé sinh ra von cục làm cho việc trích ly không đồng đều và do đó hiệu quả sẽ không cao (Lê Văn Việt Mẫn, 2011).
- Thủy phân bằng enzyme: Nhằm mục đích tăng hiệu quả thu nhận dịch xoài, mặt khác giảm độ nhớt cho dịch xoài hỗ trợ cho hoạt động của nắm men trong quá trình lên men rượu, hiệu suất thu hồi rượu sau lên men. Ảnh hưởng của việc xử lý enzyme đối với từng loại nguyên liệu và mục đích sử dụng dụng khác nhau cần có những điều kiện khác nhau. Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các yêu tố trong quá trình xử lý enzyme đối với nguyên liệu xoài nhằm mục đích thu nhận dịch dé lên men rượu. Từ những khuyến cáo của nhà cung cấp đối với các sản phẩm enzyme: nhiệt độ ủ, hàm lượng sử dụng, thời gian ủ, chúng tôi tiễn hành khảo sát thêm một số thông số chỉ tiết dé phục vụ mục đích thu nhận dịch xoài từ thịt vụn
xoải phục vụ lên men rượu.
- Loc: dịch xoài sau khi thủy phân bang enzyme trở thành dang huyền phù, quá trình lọc giúp ta thu nhận dịch lọc và bã lọc, dịch lọc có độ trong tốt hơn, việc tách bã lọc ra khỏi huyền phù thuận lợi cho quá trình lên men của nam men.
- Thanh trùng: nhằm mục đích tiêu diệt các vi sinh vật tạp nhiễm (từ nguyên liệu, các giai đoạn xử lý trước) làm ảnh hưởng đến chất lượng của quá trình lên
men. Trung quy trình này chúng tôi sử dụng phương pháp thanh trùng nhiệt, tuy
nhiên việc gia nhiệt ở mức cao sẽ ảnh hưởng đến hương vị của sản phẩm. Do đó ở giai đoạn này cần nghiên cứu để tìm ra thông số cho quá trình thanh trùng dịch
trước khi lên men.
- Phối trộn: dich sau khi thủy phân cần kiểm tra hàm lượng đường, dé điều chỉnh về hàm lượng phù hợp cho quá trình lên men. Siro sẽ được sử dụng nhằm
22
mục đích gia tăng hàm lượng đường, nước được sử dụng nhằm mục đích giảm độ
đường.
- Bồ sung chế phẩm nam men: Ché phâm nam men cần được hoạt hóa trong dung dịch đường glucose 10%, trong thời gian 10 phút (theo khuyến cáo nhà cung cấp).
Hàm lượng đường phù hợp cho quá trình lên men, tỷ lệ chế phẩm nam men
được xác định thông qua nội dung nghiên cứu 3.4
- Lên men: qua trình lên men được thực hiện ở nhiệt độ phòng nhiệt độ lên
men được duy trì ở mức 25-30°C. Quá trình lên men kết thúc khi hàm lượng chất rắn hòa tan trong dịch lên men 6n định, phần cặn lắng xuống đáy, dịch rượu trong.
Thời gian lên men (tính từ lúc bắt đầu quá trình lên men) sẽ được xác định qua nội
dung nghiên cứu 3.4.
- học: phần bã nắm men và các cấu tử lơ lửng trong dịch xoài ban đầu được lắng ở đáy thùng lên len. Dịch rượu được thu nhận bằng cách tháo dịch ở phần trên lớp cặn lắng.
- Chuẩn bị dịch vi khuẩn giấm: lây khuẩn lạc thuần của chủng vi sinh cấy vào ống nghiệm 10ml dịch tăng dịch rượu với độ cồn 1%, trong thời gian 2 ngày, tra mật độ vi khuẩn đạt (thông qua độ đục bằng phương pháp đo OD ở bước sóng 600nm). Khi kiểm tra thấy giống đạt yêu cầu thì chuyển toàn bộ dịch đó vào bình chứa 90ml dịch tăng sinh khác. Cứ tiếp tục như vậy nhân lên để có lượng giống nhiều hơn.
- Lên men giấm: Dịch rượu được phối chế để đạt độ cồn phù hợp, sẽ được bổ sung lượng giống với tỷ lệ phù hợp trộn đều và cho tiến hành lên men. Nhiệt độ lên men được 6n định 30°C+5°C (Nguyễn Trương Bao Trân, 2007). Nông độ cồn ban dau, tỷ lệ giống bé sung, thời gian lên men sẽ được xác định ở nội dung 3.5.
- Thu nhận dịch, lão hóa, đóng chai và thanh trùng:
Gidm sau khi lên men được chuyền vào thùng chứa, đậy kín. Trong giai đoạn lão hóa này các este được hình thành tạo mùi vị dễ chịu cho giấm, mặt khác mật độ vi sinh vật giảm dần theo thời gian lão hóa.
23
Giam thanh trùng bằng phương pháp gia nhiệt và làm nguội nhanh, tiễn hành
rót chai.
2.4.3.1. Nghiên cứu quá trình thu nhận dịch xoài từ thịt xoài vụn bằng phương
pháp xử lý enzyme.
Nguyên liệu xoài có chứa hàm lượng pectin cao, độ nhớt cao, làm cho hiệu
suất thu nhận dịch thấp, mặt khác ảnh hưởng xấu đến hoạt động của nam men trong quá trình lên men rượu, hiệu suất thu hồi rượu sau lên men, và chất lượng rượu sau khi lên và trong quá trình bảo quản. Ảnh hưởng của việc xử ly enzyme đối với từng loại nguyên liệu và mục đích sử dụng khác nhau cần có những điều kiện khác nhau.
Đối với việc sử dụng dịch xoài vào quá trình lên men rượu cần sự thủy phân triệt dé các phân tử pectin tạo thành các đơn phân tử. Chế phẩm enzyme thương mai là tổ hợp của các loại enzyme pectinase, mỗi loại enzyme trong tổ hợp này có cơ chất và chế tác động riêng.
Do đó, đề tài tiễn hành khảo sát ảnh hưởng của các yếu tổ trong quá trình xử lý enzym đối với nguyên liệu xoài nhằm mục đích thu nhận dịch dé lên men rượu.
Từ những khuyến cáo của nhà cung cấp đối với các sản phẩm enzyme: nhiệt độ ủ (40°C), hàm lượng sử dụng, thời gian ủ, đề tài tiến hành khảo sát thêm một số thông số chỉ tiết để phục vụ mục đích thu nhận dịch xoài từ thịt vụn xoài phục vụ
lên men rượu.
Theo kết quả nghiên cứu của Th.S Lê Thị Mỹ Phương và cộng sự về việc lựa chọn loại enzyme dé đạt hiệu suất thu nhận dịch quả cao nhất, và đảm bảo màu sắc tự nhiên của xoài. Chế phẩm enzyme pectinase do công ty Kovin cung cấp được lựa
chọn sử dụng trong quá trình thu nhận dịch từ thịt xoài vụn.
Chế phẩm enzyme này có tác dụng thủy phân pectin, giảm độ nhớt của dịch quả, nâng cao hiệu suất thu nhận dịch quả.
Khảo sát tỉ lệ nước/thịt xoài (w/w) bé sung vào nguyên liệu trong quá trình ủ
enzyme
Thịt xoài vụn sau khi rã đông được xay nhuyễn, bổ sung nước theo tỉ lệ (w/w) 1/5, 2/5, 3/5, 4/5, 5/5, khuấy đều, sau đó bố sung chế phẩm enzyme với lượng sử dụng 3UI/g nguyên liệu, tiễn hành ủ ở nhiệt độ thích hop đã lựa chọn, trong thời
24
gian 120 phút, tiến hành lọc qua vải lọc với kích thước lỗ là 250 micron. Dịch sau khi lọc được xác định các chỉ tiêu: Màu sắc, mùi vị, hình thái và hiệu suất thu nhận
dịch xoài.
Từ đó, lựa chọn tỉ lệ nước/ nguyên liệu (w/w) bồ sung thích hợp sao cho dich xoai có mau vàng của xoài tươi, mùi thơm đặc trưng của xoài, hiệu suất thu nhận dịch xoài đạt cao nhất.
Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ enzyme/nguyên liệu (w/w) và thời gian xử lý đến quá
trình thu nhận dịch xoài
Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp thực nghiệm trực giao hai yếu tố có tâm xoay với 3 thí nghiệm tại tâm theo mô hình CCF - design. Phần mềm Modde 5.0 được sử dụng để thiết kế và xử lý số liệu thực nghiệm.
Bảng 2.1. Ma trận bồ trí thí nghiệm mã hóa các biến độc lập.
Bước nhảy Mức nghiên cứu
Tên biến -1 -0,5 0 0,5 |
XI: Thời gian trích (phút) 60 90 120 150 180 X2: Tỷ lệ enzyme/nguyên liệu (ppm) 25 50 15 100 125
Bang 2.2. Ma tran quy hoach thuc nghiém.
eK ~ r eK .^ ` on
Biên mã hóa Biên thực nghiệm Hàm mục tiêu Thí nghiệm Xi Xa Xi X2 Yi Y2
NI -1 -1 60 Pi N2 -0,5 -1 90 25 N3 0,5 -1 150 nã N4 1 -1 180 25 N5 -] -0,5 60 50 N6 1 -0,5 180 50 N7 -0,5 0 90 75 N8 0,5 0 150 75 N9 -] 0,5 60 100 N10 | 05 180 100 NII -1 1 60 125 N12 -0,5 1 90 125 N13 0,5 | 150 125 N14 1 1 180 125 N15 1 180 125
25
Trong đó: 1ppm chế phẩm enzyme tương đương với 0,6UI/g nguyên liệu
Dé mô tả ảnh hưởng của các nhân tố chọn lựa trên đến các hàm đáp ứng Y, chúng tôi chọn mô hình hồi quy đa thức bậc 2 tong quát như phương trình (1):
Y = Bo + BrX1 + BoX2 + Bi2X1X2 + BnX + Bo2X2? (1) Trong đó:
+ Xi, Xo, X:: các biến độc lập
+ Bo: hệ số mô hình hồi quy
+ Bi, B2: các hệ số tuyến tính
+ Biz: các hệ số tương tác
+ Bun, B22: các hệ số bậc hai
+ YI,Y:: hàm mục tiêu, là hiệu suất thu nhận dịch trích ly (%) , hàm lượng
đường khử (mg/ml) thu được trong dịch trích. Trong thực nghiệm này, Y1, Y2 >
max.
Thực hiện: Thịt xoài được xu lý, sau đó bồ sung nước với tỉ lệ nước/nguyên liệu đã chọn , khuấy đều, bổ sung chế phẩm enzyme được chọn với tỉ lệ enzyme/nguyên liệu, rồi ủ ở nhiệt độ đã chọn với thời gian khảo sát, cuối quá trình
ủ đem lọc và thu nhận dịch.
Chỉ tiêu đánh giá:
- Hiệu suất thu nhận dịch (%)
- Ham lượng đường khử trong dich (mg/ml).
2.4.3.2. Khảo sát ảnh hưởng chế độ thanh trùng đến chất lượng của quá trình
lên men rượu từ dịch xoài.
Dịch xoài sau khi thu nhận được rót vào erlen 500ml với thé tích 500ml > gia nhiệt lên đến nhiệt độ thanh trùng, thanh trùng ở các chế độ khác nhau > làm mát đến 300C.
Chế độ thanh trùng:
- Nhiệt độ: 60, 65, 70°C
- Thời gian thanh trùng: 10, 15, 20 phút
26