2.1. Thời gian, địa điểm
2.1.1. Thời gian nghiên cứu
Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 8/2020 đến tháng 3/2022.
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu
Đề tài thực hiện việc đánh giá một số chỉ tiêu hình thái và chỉ tiêu nông học của 15 quan thé giống Hồ tiêu trồng tại các nông hộ lựa chọn trên địa bàn tinh Binh Phước và tại Trung tâm nghiên cứu và phát triển cây Hồ tiêu tỉnh Gia Lai.
Các nội dung liên quan tới sinh học phân tử được thực hiện tại Viện nghiên
cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường — Trường Dai học Nông Lâm Tp. Hồ Chí
Minh
2.2. Vật liệu, thiết bị và hóa chất thí nghiệm
2.2.1 Vật liệu nghiên cứu
Tổng số 15 quan thé giống Hồ tiêu (5 cá thé/quan thé) tương ứng với 15 giống Hồ tiêu được trồng ở các hộ dân trên địa bàn các huyện/ thị xã thuộc tỉnh Bình Phước bao gồm: Thành Phố Đồng Xoài; huyện Lộc Ninh và trồng tại Trung tâm nghiên cứu và phát triển cây Hồ tiêu tỉnh Gia Lai (bảng 2.1)
Bảng 2.1. Danh sách 15 quần thê giống Hồ tiêu sử dụng trong nghiên cứu
TT Tên giông địa Ký hiện Nơi thu Tọa độ Tuoi giông phương thập (năm)
: N: 11°48)40,8'ˆ
1 An độ AD Loc Ninh 6 E: 106°40°30,7”’
` N: 11°487509,2”’
2 Điện Thuận ĐT Lộc Ninh 6 E: 106°40’20,0’’
20
10
11
12
13
14
15
Vinh Linh
Sé Léc Ninh
Phú Quốc
Tiên Phước
Thekken
Mã Lai
Mã Lai
Srilanka
Lada
Vĩnh Linh
Tiêu xanh
Lộc Ninh
Tiên Sơn
VL
SLN
PK
TP
TK
M3
M4
Sr3
La6
VỊ9
DP6
Ll
TS
Lộc Ninh
Lộc Ninh
Đồng Xoài
Đồng Xoài
Lộc Ninh
Gia Lai
Gia Lai
Gia Lai
Gia Lai
Gia Lai
Gia Lai
Gia Lai
Gia Lai
N: 11°48°37,5”’
E: 106°40’25,8”’
N: 11°48°39”°
E: 106°40’29,6”’
N: 11°30°16,6””
E: 106°46’23,6”’
N: 11930°17””
E: 106°46’22,5”’
N: 11°48°40”’
E: 106°40’31,3”’
N: 13°57’55,5”’
E: 107°52°48,5””
N: 13°57°58,2”
E: 107°52754,8”’
N: 13°57°56,7”’
E: 107°52’53,3”’
N: 13°5756,2”
E: 107°52’48,4”’
N: 13°57'56””
E: 107°52’48,7”’
N: 13°57755,9”’
E: 107°52°48,6””
N: 13°57°56,8”’
E: 107°52’48”’
N: 13°57'56,5”
E: 107°52’48,9”’
21
2.2.2 Hóa chất và thiết bị thí nghiệm 2.2.2.1 Hóa chất
a) hóa chất li trích DNA:
dung dịch li trích Buffer CTAB (4% w /v cTAB; NaCl 1,4 M; 100 mM Tris- HCl, pH 8; EDM 20 mM; PVP 2% và 0,1% v / v b-mercaptoethanol); chloroform:
iso-amyl alcohol (24: 1); Isopropanol; Ethanol va dung dich TE.
c) Hóa chat PCR:
- MyTaqMix, 2x (Meridian Bioscience Inc., Mỹ)
- Primer SSR dựa theo nghiên cứu được công bố của tác gia (Kumari va
ctv, 2019)
c) Hóa chất dùng trong điện di:
Hóa chất dùng trong điện di gồm: thang chuẩn DNA Ikb và 100bp (HyperLadder 1kb và HyperLadder 100bp, Meridian Bioscience Inc., Mỹ); thuốc
nhuộm - Midori Green Nucleic Acid Staining Solution (Bulldog Bio, Mỹ); dung dịch đệm TBE (1X): Boric acid (Merk, Đức), Ethylenediaminetera acetic acid (Sigma, Mỹ), Tris Base (Merk, Đức)
2.2.2.2. Thiét bi thi nghiém:
a) Thiết bị do đếm các chỉ tiêu nông học, hình thái ngoài dong ruộng:
Thước lase; kính ngắm; máy định vi GPS; thước kẹp, tuoc day...
b) Thiết bị phân tích phòng thí nghiệm:
Đề tài sử dụng các thiết bị phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thuộc bộ môn sinh học phân tử công nghệ gen và tế bào- Viện nghiên cứu công nghệ sinh học và
môi trường- trường đại học Nông Lâm TPHCM.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp thực hiện nội dung 1: Đánh giá sự đa dạng di truyền các quần thể giống Hồ tiêu dựa trên các các đặc điểm hình thái học
Các đặc điểm hình thái học được đánh giá theo tiêu chí hướng dẫn bởi Viện Tài Nguyên di truyền thực vật Quốc tế.
22
a) Đánh giá các đặc điểm hình thái học của các quần thể giống Hồ tiêu
(1) Chiều cao cây (cm): chiều cao của cây xác định tương ứng chiều cao trụ tiêu đã phủ tán. Do 5 trụ sau đó lấy giá trị trung bình
(2) Đường kính tán (cm): Do và lay giá trị trung bình 2 đường thang vuông góc (3) Chiều dài lá: Do chiều dai 5 lá/ trụ; đo 5 trụ/ quan thé sau đó lấy giá trị trung
bình
(4) Chiều rộng lá: Do chiều dai 5 lá/ trụ; đo 5 trụ/ quan thé sau đó lấy giá trị trung
bình
(5) Hình dang lá: Quan sát xác định hình dang (oval, elipe...)
(6): Kiều gân lá: Quan sát dé xác định kiểu gân: chân chim, xương cá (7): Màu sắc lá non: Quan sát bằng cảm quan
(8): Mau sắc lá già: Quan sát bằng cảm quan
b) Đánh giá các đặc điểm nông học của cacquan thể giống Hồ tiêu
(1) Số gié/ cành cấp 1: đếm số gié/ cành cấp 1/trụ, đếm 5 trụ / quan thé va lay kết
quả trung bình
(2) Chiều dai gié: Do chiều dai 5 gié/ trụ. Do 5 trụ/ quan thé, sau đó lấy giá trị trung
bình
(3) Số hạt chắc/gié: Đếm số hạt chắc 5 gié/ trụ, đếm 5 trụ tiêu/ quần thé. Số hạt chắc/ gié được tính: lấy số hạt chắc chia cho số gié
(4) Năng suất hạt tươi/trụ (kg/trụ): Thu hoạch từng đợt và cân khối lượng hạt tươi của từng trụ, sau đó tính tông khối lượng;
(5) Năng suất hạt khô (kg/trụ): Tiến hành phơi khô ngay sau khi thu hoạch từng đợt, tính tổng khối lượng hạt sau khi phơi (độ âm sau khi phơi khoảng 12%)
(6) Khối lượng 1000 hat tươi (g): Hạt thu hoạch được rửa sạch, để ráo nước rồi tiến hành cân 03 lần, mỗi lần 1000 hạt, sau đó tính trung bình khối lượng;
(7) Khối lượng 1000 hạt khô (g): Hạt sau khi được phơi khô (độ 4m khoảng 12%) được lấy rồi tiến hành cân 03 lần, mỗi lần 1000 hạt, sau đó tính trung bình khối lượng;
23
(8) Dung trọng hat (g/l): Phơi khô hạt tiêu đến độ âm khoảng 12%, dùng ống dong thé tích 1 lít để đong, sau đó đem cân khối lượng hạt tiêu vừa đong ta được dung
trọng hạt.
(9) Tỷ lệ hạt tươi/ hạt khô: Phơi khô Ikg hạt tiêu tươi đến độ 4m khoảng 12%, cân khối lượng hạt tiêu khô thu được, tính tỷ lệ.
Tiến hành xử lý các số liệu liên quan tới các chỉ tiêu hình thái học bằng phần mềm Excel và phân tích số liệu
2.3.2. Phương pháp thực hiện nội dung 2: Đánh giá sự đa dạng di truyền các quần thể giống Hồ tiêu bằng chỉ thị phân tử SSR
a) Phương pháp tách chiết DNA
DNA các mẫu lá tiêu được phân lập theo quy trinh (Doyle và Doyle, 1990) có chỉnh sữa: 5 g mô lá tươi được nghiền 600u1 dung dich li trích Buffer CTAB
(4% w/v cTAB; NaCl 1,4M; 100 mM Tris-HCl, pH 8; EDM 20 mM; PVP 2% và 0,1% v / v b-mercaptoethanol).
Ủ mẫu ở 60°C trong 30 phút, sau đó ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở
nhiệt độ phòng.
Hút 400 il nổi sang tube mới, thêm 400 pl chloroform: iso-amyl alcohol (24:
1) lắc đều và ly tâm ở 10000 vòng / phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.
Hút 300 ul nổi sang tube mới, thêm 300 pl chloroform: iso-amyl alcohol (24:
1) lắc đều và ly tâm ở 10000 vòng / phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.
Hút 200 pl nỗi sang tube mới, thêm 120 pl Isopropanol, lắc đều và ủ ở -20°C
trong 30 phút, sau đó ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút.
Đồ bỏ dịch nổi, thêm 400 pl Ethanol 70°, ly tâm 12000 vong/phut trong 3 phút, thực hiện lại lần 2, sau đó đồ bỏ dịch nỗi, phơi khô. Thêm 50 ul TE và bảo quản ở tủ đông -20°C.
b) Phương pháp kiểm tra DNA
Phương pháp định tính DNA bằng điện di Cách tiến hành:
24
- Pha gel agarose với nồng độ 1%: Cân 0,125 g agarose cho vào 12,5 ml dung dịch TAE 0,5 X. Dun sôi bang lò Viba ở bước sóng 650 W cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Dé nguội đến khoảng 60°C.
- Đồ gel, chờ agarose đông.
- Load mẫu vào các giếng với tỷ lệ 10 uL loading dye thuốc nhuộm va 5 pl DNA mẫu.
- Chạy điện di ở điều kiện 80 V, 100 mA, thời gian 20 phút.
Cho gel vào máy GelDoc đọc kết qua. Nếu mẫu có DNA thì băng DNA sẽ
phát sáng dưới dạng vạch trên gel điện di. Độ tập trung và độ đậm nhạt của băng
điện đi phản ánh độ tinh sạch và nồng độ cao hay thấp của mẫu DNA.
Phương pháp định lượng DNA bằng quang phổ kế
- Giá trị ODaso/ODaso = 1,8 đến 2,2 thì dịch trích DNA được coi là tinh sạch.
- Hàm lượng DNA được tính theo công thức:
DNA (ng/uL) = [(62.9 * OD260nm) — (36 * OD280nm)] * Độ pha loãng
DNA sau khi tach chiết và kiểm tra định tinh, định lượng sé được được pha loãng trong nước cất vô trùng đến nồng độ 15 ng /uL Bảo quản ở 4° C dé dùng cho việc chạy PCR với mỗi SSR.
c) Thực hiện PCR- SSR
Để giúp quan sát rõ các vạch băng khuếch đại trên kết quả PCR-SSR, đề tài kế thừa 11 chỉ thị SSR có kích thước đoạn khuếch đại có độ lớn từ 200-450bp trong
nghiên cứu của Kumari và cộng sự năm 2019, (bảng 2.2).
5 mau DNA tương ứng 5 cá thé/ quần thê giống được chạy PCR lần lượt với 11 primer SSR. Tổng 15 quan thể tương ứng với 825 phan ứng, thí nghiệm bố trí
không lặp lại.
Phản ứng PCR thể tích 20ul bao gồm 15ng DNA, 10 pl MyTaq Mix 2X, 0,5
ul primer F, 0,5 HÌ primer R và 8 wl nước khử ion (bang 2.4).
Chu trình nhiệt phản ứng PCR-SSR của 11 primer đã được tôi ưu hóa tai
Viện nghiên cứu công nghệ sinh học và môi trường- trường đại học Nông Lâm
TPHCM. Nhiệt độ bat cặp tối ưu cho 11 primer là 55°c (Bảng 2.3).
25
Bảng 2.2. Danh sách và trình tự 11 primer SSR được sử dụng trong nghiên cứu (Kumari va cộng sự năm 2019)
SSR Kích thước T Prim Forward primer Reverse primer 7
moti đoạn khuêch T erID (5’-3’) (5’-3’)
f dai BPssr TAGGCGGTGG TGCATACCCAC
1 GA 200-450 3 CAAAACAGT CACATACGT
BPssr CTTCTGTGAT GTGATGACCAG
2 GA 200-400 4 GGGCGAAGGT CTCTTGCCT
BPssr CCTACCGAGA GCAGTCGGGCA
3 TG 200-300 11 GCTTGAGCAC CTCTACATT
BPssr GTTGAGCCCG GCTCCTTTCTGA
4 TA 200-300 _16 TCACATACCA CCTGCCAT
BPssr TCAATTGACG GATCAGACCAG
5 ATT 200-400 _ TGGGCACTGT CCCACCTTC
BPssr TAAACAGCAA ACCAAAAATTC
6 TAT 200-400 2i GGCCCCAAGT CACGGCAGC
BPssr TGCATGCGTA AAGTGCATCAC
7 ATT 200-400 _29 CCTTCACCTT AATGGCCCT
BPssr AAGCTTGATG TGACATCCAAA
8 ATT 250-350 _32 CCTTCCCTCA TCTGGCCGT
BPssr GAGTTCCACC ATTACATAAGC
9 TTA 250-300 _33 ACCAGCTACC CGGCTCGCA
BPssr ACGCACAAAG TGCGCACAGAT
10 TTA 300-400 _38 CATGCATGAG TAGCCTTCA
BPssr TCTGCTCTTG ACACGTGTCAG
11 TAA 300-400 40 ATGGTGGCAG GAAATCCCC
26
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt tối ưu trong phản ứng PCR cho 11 primer
Giai đoạn Nhiệt độ (°C) Thời gian Số chu kỳ Tiền biến tính 95 5 phút | Biến tính 95 1 phút
Bắt cặp 55 1 phút } 95
Kéo dai 72 1 phut
Hau kéo dai 72 10 phút |
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR
` À š 5 Nông độ cuối Ree
Thanh phan ồ ô đầ Ệ Thê tích (ulp Nông độ đầu (phản ứng) (ul)
MyTaq Mix 2X 1X 10 Primer -F 10pM/ ul 0,4 pM/ ul 0,5 Primer -R 10pM/ ul 0,4 pM/ ul 0,5 Khuôn DNA 1
Thêm nước cat cho đủ 20
Sản phẩm PCR-SSR được điện di trên gel agarose 1% trong môi trường 0.5X (Tris-borate-EDTA) với hiệu điện thế là 100V, cường độ 100mA và thời gian điện di là 30 phút. Sử dụng thang chuẩn 100bp DNA làm thước đo kích cỡ của các đoạn DNA khuếch đại. Sau khi điện di, gel được chụp trên anh đèn tia UV, hình anh
được lưu lại mã hóa cho phân tích.
+ Phân tích số liệu
Sau khi điện di kết quả SSR, các band khuếch đại rõ ràng được sử dụng trong phân tích. Thông tin về chất lượng của các primer được xác định thông qua hệ số
PIC (Polymorphism information content) theo công thức của Chesnokov va Artemyeva (2015).
PIC; =1- > Pi.
27
Trong đó ¡ là band vạch thứ ¡ của primer j, n là số lượng band vạch của primer j, P là tần số của band vạch. Sản phẩm SSR được mã hoá theo phương pháp nhị phân: vi trí có band vạch là “1”, vi trí không xuất hiện là “0”.
+ Phân tích nhóm đa dạng di truyền
Phân tích nhóm được xây dựng dựa trên thuật toán UPGMA (unweighted pair group method with arithmetic mean and the algorithm) với module SAHN
trong phan mềm NTSYS-pc 2.1 (Numerical Taxonomy System Softwave) và phan mém Popgene 1.32.
28
Chương 3