3.1. Thu thập, phân lập nam Colletotrichum spp. trên ớt
Các mẫu bệnh than thư trên quả của giống Ot Sừng Đỏ được thu thập tại xã Ka Đô huyện Đơn Dương tỉnh Lâm Đồng, đối với các mẫu thán thư trên quả của giống Ớt Chỉ Thiên được thu thập tại xã Suối Đá huyện Dương Minh Châu tỉnh Tây Ninh. Việc thu thập và nhận biết mẫu bệnh dựa vào triệu chứng gây hại của nam Colletotrichum spp. được Fangling Liu và ctv., mô ta năm 2016 như sau: Đối với vết bệnh trên quả có màu nâu đen hoặc xám, thường có dịch nhày và lõm. Nếu quả ớt bị gây hại nặng tại vết bệnh có thé xuất hiện đĩa cành màu đen li ti. Các vết bệnh phát triển và liên kết với nhau dan dan lan rộng ra dẫn đến hiện tượng quả bị khô.
60 mẫu nam Collectotrichum spp. được phân lập trên môi trường WA từ các mẫu bệnh đã thu thập được. 3 ngày sau phân lập, các mẫu nam được caytruyén sang môi trường PGA. Sau lần cấy truyền thứ ba, loại bỏ những đĩa bị tạp nhiễm, thu được 32 đĩa Colletotrichum spp. phát triển trên môi trường PGA thuần. Trong 32 đĩa trên có 17 đĩa có nguồn gốc từ mẫu bệnh thu thập ở Lâm Đồng, được kí hiệu là LD và
đánh số từ 01 đến 17. 15 đĩa còn lại có nguồn gốc từ mẫu bệnh thu thập ở Tây Ninh, được kí hiệu là TN và đánh số từ 01 đến 15.
3.2. Định danh Colletotrichum sp. bằng đặc điểm hình thái và trình tự ITS 3.2.1. Định danh nam Colletotrichum sp. bằng đặc điểm hình thái
Quan sát đặc điểm hình thái của 32 đĩa Colletotrichum spp. trên môi trường PGA 7 ngày sau cấy và dựa vào khóa phân loại Colletotrichum spp. của Sutton năm
1995, các mẫu nắm được chia thành 3 nhóm như sau:
Nhóm I gồm 12 mẫu: LD01, LD02, LD03, LD04, LD05, LD06, LD07, TN01, TN02, TN03, TN04, TNOS. tan nam có hình dang tròn hoặc hoi tròn, màu trắng hoặc cam hồng. Mặt trên của đĩa nắm xuất hiện những cham nhỏ màu đen, không có những đường tròn đồng tâm. Mặt dưới tản nam có màu hồng cam hoặc hơi vàng, các cham nhỏ màu đen và đậm dan gần tâm.. sợi nam mau trắng, có vách ngăn và phân nhánh, mọc sát mặt thạch,. Bào tử đơn bào, trong suốt, hình trụ hai đầu tròn hoặc một đầu tròn một đầu nhọn. Giác bám có màu nâu đến nâu đen, có dạng hình elip hoặc trứng ngược. Các mẫu nam nhóm I thuộc phức hợp loài Colletotrichum acutatum.
Colletotrichum spp. mọc trên môi trường PGA 7 ngày sau cấy, (b). mặt sau đĩa nam Colletotrichum spp. mọc trên môi trường PGA 7 ngày sau cấy, (c). hình dạng bao
Nhóm II chỉ có một mẫu duy nhất một mẫu là TN11 phân loại dựa trên hình thái
bào tử và giác bám mà Sutton đã mô phỏng 1995 như hình 3.3
Hinh 3.3 Hình thái bao tử và giác bám của Colletotrichum coccodes do Sutton mô phỏng 1995
a b c
Hình 3.4 Đặc điểm hình thai của các mẫu nam nhóm II, (a). mặt trước đĩa nấm Colletotrichum spp. mọc trên môi trường PGA 7 ngày sau cấy, (b). mặt sau đĩa nam
Colletotrichum spp. mọc trên môi trường PGA 7 ngày sau cấy, (c). hình dang bào
tử, (d). hình dạng giác bám
Nhóm III gồm 13 mẫu nắm: LD08, LD09, LD10, LD11, LD12, LD13, LD14,LD15,
LD16, LD17 và TN06, TN07, TN08, TN09, TN10, TN12, TN13, TN14, TN15 phân
0008
Hình 3.5 Hình thái bao tử và giác bám của Colletotrichum gloeosporiodes do
T1Ok+
Sutton miêu tả 1995
Hình 3.6 Đặc điểm hình thái của các mẫu nắm nhóm III, (a). mặt trước đĩa nam Colletotrichum spp. mọc trên môi trường PGA 7 ngày sau cay, (b). mặt sau đĩa nam
Colletotrichum spp. mọc trên môi trường PGA 7 ngày sau cấy, (c). hình dang bào
tử, (d). hình dạng giác bám.
3.2.2. Định danh nam Colletotrichum sp. bằng trình tự 16S-RNA
Do phân loại nam Colletotrichum chỉ dựa vào các đặc điểm hình thái đã tạo ra nhiều nhằm lẫn nên vai trò của phân tích phân tử ngày càng trở nên quan trọng trong phân loại nhóm nam này (Cannon và ctv, 2000).
600 bp
MS
=