Phần II: VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.2.2. Quan sát hình thái tế bào NAM rmen
Việc xác định hình thái và kích thước tế bào nấm men tiến hành khi
tế bào còn trẻ, đó là thời kì hình thái của chúng tương đối ổn định nhất.
Các chủng nghiên cứu được cấy chuyền từ thạch nghiêng sang ống nghiệm chứa 10ml môi trường Hansen dịch thể, để vào tủ ấm 2- 3 ngày ở 28-30°C sau đó lấy ra làm tiêu bản rồi quan sát hình thái tế bào.
Các đặc điểm cần xác định là :
* Hinh dạng tế bào.
® Số lượng tế bào nảy chi.
* S6 lượng tế bào chết (đùng phòng đếm Thoma —Goriaêv).
SVTH: Ngô Mỹ Yến Trang 28
CBHD: TS.Trần Thanh Thủy Luận văn tốt nghiệp Muốn phân biệt tế bào sống chết ta tiến hành làm tiêu bản giọt ép bằng thuốc nhuộm xanh métylen 0,01%. Tế bào sống không bất màu
hoặc bất màu xanh nhạt, tế bào chết bắt màu xanh đậm hơn.
Muốn quan sát tế bào nấm men một cách tỷ mỉ hơn có thể dùng một số thuốc nhuộm để nhuộm các tế bào nấm men. Dùng que cấy lấy 1
giọt dung dịch nuôi cấy nấm men đưa lên phiến kính sạch, dàn mỏng giọt dung dịch trên phiến kính, làm khô và cố định vết bôi bing ngọn lửa
đèn cổn. Nhuộm mau bằng Fuchsin kiểm hoặc xanh mêtylen, để 1 phút sau đó dùng nước cất rửa sạch tiêu bản, để tiêu bản khô tự nhiên hay dùng giấy lọc thấm cẩn thận, quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi quang
học ở vật kính x100 bằng dầu soi kính.
2.2.2.3. Đo kích thước tế bào [9]:
*Các dụng cụ do:
Thước do vật kính là một phiến kính tốt ở giữa có 1 vạch khắc đài | mm, chia thành 100 khoảng mỗi khoảng dài 10um.
Thước đo thị kính là một bản thủy tỉnh hình tròn, ở trung tâm có
một vạch dài 5mm chia ra làm 50 khoảng cách đều nhau.
*Cách áo:
Nuôi nấm men trên môi trường Hansen dịch thể, sau 48 giờ đem làm tiêu bản giọt ép để đo.
Đặt thước đo vật kính lên bàn kính (chỗ để tiêu bản), điều chỉnh sao cho vạch chia nằm giữa quang trường. Lắp thước đo thị kính vào, quay thước đo thị kính sao cho các vạch chia của nó nằm song song các
vạch chia của thước đo vật kính. Làm trùng một vạch chia của thước đo vật kính với một vạch của thước đo thị kính, sau đó tìm vạch trùng tiếp
theo. Xác định bao nhiêu khoảng chia của thước đo vật kính tương ứng
SVTH: Ngô Mỹ Yến Trang 29
CBHD: TS.Trần Thanh Thủy Luận văn tốt nghiệp
với một vạch của thước đo thị kính và tính giá trị mỗi khoảng chia bằng
ụm.
Ví du: trong 4 vạch của thước đo vật kính (40um) chứa 13 vạch của
thước đo thị kính, mỗi vạch của thước đo thị kính ở độ phóng đại tương
ứng 40/13=3,08 pm.
Bỏ thước đo vật kính ra, thay bằng tiêu bản vi sinh vật, diéu chỉnh thước đo thị kính trùng hướng tiêu bản muốn đo. Kích thước tế bào bằng
số khoảng chia của thước đo thị kính nhân với hệ số đo.
Yêu câu: mỗi tế bào được đo chiéu dài và chiều rộng. Mỗi mẫu do số tế bào không ít hơn 20, sau đó lấy trị số trung bình và chỉ đo các tế
bào đã trưởng thành.
2.2.3. Các phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của
nấm men [1].
2.2.3.1. Quan sát hình thức nảy chéi ở tế bào nấm men:
Nay chổi là một chỉ tiêu trong phân loại nấm men, đa số nấm men
đều sinh sản vô tính bằng hình thức nảy chổi. Nuôi cấy nấm men trong
môi trường Hansen dịch thể (MT 2) ở 25-30°C trong 1-2 ngày có thể
quan sát được quá trình nảy chổi của nấm men. Khi quan sát quá trình này dưới kính hiển vi cần phân biệt được chổi hình thành là chổi một cực hay đa cực, số lượng chổi con hình thành trên mỗi tế bào mẹ, chổi con phát triển có tách khỏi tế bao mẹ hay không...
2.2.3.2. Quan sát khuẩn ty của nấm men:
Một số nấm men phát triển trong những môi trường già hay điều
kiện thiếu oxi có thể hình thành những tế bào dai, xếp nối tiếp nhau được gọi là giả khuẩn ty. Cũng có một số nấm men khi phát triển trong diéu kiện bình thường cũng tạo khuẩn ty. Khuẩn ty giả chưa hình thành
SVTH: Ngô Mỹ Yến Trang 30
CBHD: TS.Trần Thanh Thủy Luận văn tốt nghiệp
sợi rõ rệt mà chỉ là nhiều tế bào nối với nhau thành chuỗi dài. Sự tạo
thành khuẩn ty là một đặc điểm quan trọng trong phân loại nấm men.
Để kiểm tra sự tạo thành khuẩn ty, nuôi cấy nấm men trên môi trường 9. Môi trường được đổ vào hộp pêti sao cho càng mỏng càng tốt.
Dùng que cấy, cấy nấm men thành ba đường song song. Dùng panh lấy lá kính mỏng (thường xuyên ngâm trong cồn) đốt nhẹ cho hết cổn, để
nguội một chút rồi đặt nhẹ nhàng lên vết cấy. Phải cấy để 3 đường cấy song song có chiểu ngang nằm gọn trong lá kính mỏng, hai đâu dài hơn
một chút. Sau khi đậy lá kính một cách nhẹ nhàng và cẩn thận, đậy hộp
pêtri lại và nuôi trong tủ ấm ở 25-30°C trong 3-5 ngày. Lấy ra và quan sát các vết cấy dưới kính hiển vi. Bằng phương pháp này dễ dàng quan
sát thấy sự tạo thành khuẩn ty ở một số loài nấm men.
2.2.3.3. Quan sát nang bào từ của nấm men:
* Nguyên tắc: nấm men sinh sản hữu tính bằng bào tử túi hay còn gọi là bào tử nang. Tế bào chứa bào tử nang gọi là nang. Thường quan
sát thấy nang bào tử của nấm men trong các môi trường già.
*Phương pháp: nuôi nấm men 2 ngày trong môi trường 2. Cấy ria
ở mật độ cao lên các ống thạch nghiêng chứa môi trường 10, ủ ấm ở 28°C trong 10-15 ngày rdi làm tiêu bản soi tươi (không cần nhuộm) để
quan sất nang bào tử.
* Yêu cầu:
-Phân biệt các dang nang: nang tiếp hợp do sự dung hợp của nhân tế bào mẹ và chổi hay nang tiếp hợp do sự dung hợp của 2 tế bào riêng
biệt. Nang nằm riêng biệt bên ngoài tế bào.
- Xác định số lượng bào tử trong mỗi nang.
- Đặc điểm của vách bào tử nang.
SVTH: Ngô Mỹ Yến Trang 31
CBHD: TS.Trần Thanh Thủy Luận văn tốt nghiệp
- Mô tả hình dạng bào tử: hình cầu, hình thận, hình nón, hình sao thổ, hình kim xoắn, hình sao, hình thoi.
2.2.3.4. Xác định khả năng sử dụng nitrat làm nguồn nite của nấm
men:
*Nguyén tắc: Một số nấm men có khả năng sử dung nitrat làm
nguồn nitơ và khử nitrat thành nitrit hoặc NH, có khi thành N; .
Khả năng khử NO; thành NO; là một trong các chỉ tiêu phân loại
nấm men. Để xác định sự tạo thành NO; dùng thuốc thử Griss I và Griss
Il.
* Dat thi nghiệm:
_ Lô đối chứng 1: Các ống nghiệm chứa môi trường cơ sở (MT6).
_Lô đối chứng 2: Các ống nghiệm chứa môi trường cơ sở có bổ
sung thêm pepton 1%.
_Lô thí nghiệm: Các ống nghiệm chứa môi trường cơ sở có bổ sung
thêm nguồn nits dưới dạng KNO; .
Môi trường được thanh trùng ở 1 atm trong 30 phút. Mỗi chủng nấm men cấy vào 3 loại môi trường trên. Nuôi cấy nấm men trong tủ ấm từ 5- 7 ngày. Cứ sau một thời gian nhất định lấy một ít dịch nuôi cấy thử xem
có hoạt tính hay không.
*Kiểm tra hoạt tính:
Lấy 1-2 giọt dịch nuôi cấy cho vào bản sứ lõm. Nhỏ một giọt thuốc thử Griss I và một giọt thuốc thử Griss II. Nếu có mặt nitrit dịch nuôi cấy
có mau đỏ.
Cách pha thuốc thừ Criss I va Criss I:
CrissI: Acid Sunfunilic 0,5g.
Acid Acetic 150ml.
SVTH: Ngô Mỹ Yến Trang 32
CBHD: TS.Trần Thanh Thủy Luận văn tốt nghiệp
Criss II: Naphtylamin 0,5g.
Acid Acetic 150ml.
Nước cất 50ml.
Hòa Naphtylamin vào nước rồi mới bổ sung acid Acetic.
2.2.3.5. Xác định khả năng phân giải urê của nấm men:
* Nguyên tắc:
Phân giải urê cũng là một chỉ tiêu trong phân loại nấm men. Một số
nấm men có khả năng tạo thành enzim ureaza do đó có thể phân giải urê tạo thành NH; làm kiểm hóa môi trường.
* Phuong pháp:
Để xác định khả năng tạo enzim ureaza, cho vào môi trường 7 chất chỉ thị mau là phenol đỏ. Cay nấm men, nuôi ở tủ ấm 3-5 ngày, nếu thấy vết cấy chuyển màu đỏ hồng, chứng tỏ nấm men có khả năng phần giải
urê.
Phản ứng xảy ra như sau:
O=z=C-(NH;; + 2H,0 > (NH,),CO; > 2NH; + H;CO;
NH; phản ứng với chất chỉ thị phenol đỏ làm vết cấy chuyển màu
đỏ.
2.2.3.6. Xác định khả năng lên men các loại đường:
Khả năng lên men các loại đường là một chỉ ti€u quan trọng trong phân loại nấm men.
* Nguyên tắc: Dựa vào sự thay đổi màu sắc, độ đục của môi trường
và lượng CO; tạo thành trong dịch lên men.
* Phương pháp:
-Dùng MT 8 với các loại đường: glucose, d- galactose, lactose,
saccarose, maltose, fructose và dextin.
SVTH: Ngô Mỹ Yến Trang 33
CBHD: TS.Trần Thanh Thủy Luận văn tốt nghiệp -Chuẩn bị các bình lên men Einhorn - Smith vô trùng. Sau khi khử trùng môi trường cho 9ml môi trường vào mỗi bình rồi bổ sung 1ml giống đã hoạt hóa vào mỗi bình sao cho đẩy ống chia độ (không để xuất hiện
bọt khí). Khảo sát khả năng lên men của nấm men sau 8 giờ ở 28 —3Œ°C.
Nếu nấm men có khả nang lên men đường chứa trong môi trường sẽ sinh
ra khí CO; đẩy môi trường xuống:
- Môi trường chuyển màu rõ, lượng CO; nhiều: lên men mạnh.
- Môi trường chuyển màu không rõ,lượng CO; ít: lên men yếu.
- Môi trường không chuyển màu, không tạo CO;: không lên
men.
2.2.4. Chọn môi trường tối wu cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm men bằng phương pháp đếm số lượng tế bào bằng khung đếm
Thoma-Goriaêy [18]:
Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 9ml các môi trường 2, 3, 4, 5 vô
trùng.
Giống được hoạt hóa trong 24 giờ trên máy lắc với chế độ 130 vòng/phút sau đó diéu chỉnh lượng giống vào các môi trường trên bằng
nhau (xấp xi 0,3 triệu tế bao/ml), nuôi cấy 28-30°C trong 24 giờ. Kiểm
tra số lượng tế bào bằng khung đếm Thoma-Goriaév tại các thời điểm: 0,
3,6, 9, 12, 15, 18 ,21, 24 giờ...
Phương pháp:
* Nguyên tắc: dựa vào thể tích của khung đếm để tính số tế bào có trong 1ml dịch nuôi cấy.
Khung đếm là một phiến kớnh day ở giữa cú một chỗ lửm phẳng, tại đây có kẻ một | lưới gồm 400 hình vuông, có diện tích tổng cộng Imm?
vậy diện tích | ô nhỏ =1/400 mm? và một ô vuông lớn =1/25mm’.
SVTH: Ngô Mỹ Yến Trang 34
CBHD: TS.Trần Thanh Thủy Luận văn tốt nghiệp
*Cách đếm:
* Pha loãng dịch huyển phù nấm men đến néng độ
thích hợp.
* Nhé dịch huyền phù nấm men vào cạnh lamelle (đã
đặt trên phòng đếm), chú ý không để bọt khí.
* Quan sát ở vật kính x40,
* Đếm số lượng tế bào ở 5 6 lớn với 5 vị trí khác nhau.
Chú ý: sau khi nhỏ giọt vào khung đếm để 3-5 phút để các tế bào lắng xuống và cùng nằm trên một mặt phẳng mới bất đầu xác định số
lượng.
Cỏch tớnh: N= : ơ
N: Số tế bào/ml.
a: Số tế bào trung bình trong 1 ô nhỏ.
n: Độ pha loãng huyền phù.
h: chiểu sâu của khung đếm.
s: diện tích ô nhỏ.
2.2.5. Khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tế môi trường đến khả năng tạo sinh khối của tế bào bằng phương pháp cân sinh khối tươi.
2.2.5.1. Ảnh hưởng của pH:
Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 9ml mồi trường 3 vô trùng.
Dùng NaOH 0,1 N hoặc acid citric, diéu chỉnh pH môi trường đạt
các giá trị 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5.
Giống được hoạt hóa sau 24 giờ trên máy lắc với chế độ 130
vòng/phút sau đó điều chỉnh lượng giống vào các môi trường pH trên
bằng nhau (xấp xỉ 0,3 triệu tế bào/ml), nuôi cấy 28-30°C trong 24 giờ.
SVTH: Ngô Mỹ Yến Trang 35
CBHD: TS.Trần Thanh Thủy Luận văn tốt nghiệp Cân lượng sinh khối tạo thành tại các thời điểm: 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18
„21, 24 giờ.
2.2.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ:
Cách bố trí thí nghiệm như trên chỉ khác yếu tố cẩn thay đổi là
nhiệt độ.
Cân lượng sinh khối tạo thành tại các thời điểm tương tự như thí
nghiệm trên ở các nhiệt độ: 25°C; 30°C; 35°C; 40°C.
2.2.5.3. Ảnh hưởng của cường độ thông khí:
Giống được hoạt hóa trên máy lắc, tốc độ 130 vòng/phút trong 24
giờ ở nhiệt độ phòng (30°C). Sau khi hoạt hóa, giống được cho vào môi
trường nhân giống với số lượng xấp xỉ 0,3 triệu tế bao/ml.
Lắc ở những tốc độ khác nhau: không lắc (0 vòng/phút), 100
vòng/phút, 130 vòng/phút, 150 vòng/phút va 170 vòng/phút.
Cân lượng sinh khối tạo thành ở các thời điểm: 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18,
21, 24 giờ với mỗi chế độ lắc trên.
2.2.6. Khảo sát khả năng kháng các kháng sinh của chủng nấm
men bằng phương pháp dùng đĩa kháng sinh chuẩn [8]:
Cấy chủng nấm men đã hoạt hóa sau 24 giờ trên máy lắc với chế độ 130 vòng/phút rồi cấy trải trên các đĩa pêtri có chứa môi trường 2
agar, sau đó đặt các đĩa giấy có tẩm chất kháng sinh lên mặt thạch. Để sau 24 giờ rồi kiểm tra vòng vô khuẩn.
2.2.7. Bảo quản nấm men bằng phương pháp đông khô [11]:
* Nguyên tắc:
Phương pháp đông khô làm thăng hoa phẩn nước có trong môi trường nhũ hóa vi sinh vật ở điều kiện áp suất thấp. Uu điểm của phương pháp này là tỷ lệ sống sót của vi sinh vật rất cao, các đặc tính di truyén
SVTH: Ngô Mỹ Yến Trang 36
CBHD: TS.Trần Thanh Thủy Luận văn tốt nghiệp
của vi sinh vật không bị biến đổi, và thời gian giữ giống được kéo dài khá lâu, ít tốn công sức để cấy truyền nhiều lin.
* Cách tiến hành:
Nuôi vi sinh vật trên môi trường 3 đến giai đoạn logarit, thu sinh khối tế bào bằng cách li tâm lạnh rồi trộn với các chất bảo vệ, các ống
có giống vi sinh vật đã chuẩn bị vào làm lạnh ở nhiệt độ - 20C, trong
khoảng 1-5 phút, tiếp theo đưa vi sinh vật vào làm khô trong thiết bị
đông khô ở áp suất 10 Hg sau 24 giờ. Các ống giống khi đã khô được đem han kín lại và bảo quản ở nhiệt độ phòng hoặc để trong tủ lạnh đều
được.
Người ta thường ding môi trường 11 để trộn vào giống vi sinh vật
nhằm bảo vệ vi sinh vật khi đông khô không bị chết do sự hình thành các
tinh thể nước (H;O), cũng như chống các quá trình oxi hóa v.v...
2.2.8. Xác định khả năng sống sót sau đông khô:
Khả năng sống sót sau đông khô được xác định bằng phương pháp
xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm khuẩn lạc mọc trên
môi trường thạch [ 18).
* Nguyên tắc:
Cấy một thể tích xác định huyển phù cẩn nghiên cứu lên môi
trường đặc trưng trong đĩa pêtri. Xác định số lượng tế bào bằng cách
đếm số khuẩn lạc mọc lên sau thời gian nuôi cấy vì mỗi khuẩn lạc là kết quả của sự phát triển của một tế bào.
* Tiến hành:
Pha loãng dịch huyền phù ở các nổng độ khác nhau: 10° ,10', 10°
để cấy mẫu.
SVTH: Ngô Mỹ Yến Trang 37
CBHD: TS.Trần Thanh Thủy Luận văn tốt nghiệp Dùng ống pipet vô trùng lấy 0,1 ml dich huyén phù cho vào mỗi đĩa
thạch chứa môi trường 2.
Dùng que gạt dàn thật đều trên khắp mặt thạch để tách riêng từng
tế bào. Mỗi mẫu lấy 3 nông độ liên tiếp, mỗi nồng độ cấy 3 đĩa pétri và
lấy kết quả trung bình.
Đặt các đĩa thạch vừa cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 28-30°C sau 2-3
ngày đếm số lượng khuẩn lạc.
Số lượng ví sinh vật trong một gam mẫu được tính theo công thức:
Số tế bào/g mẫu = M.a.10°.N
M: Số khuẩn lạc tế bào trong một đĩa pétri.
a: Số giọt đếm được trong lmÌ mẫu.
n: độ pha loãng dịch huyền phù.
N: Hệ số tính theo khối lượng khô tuyệt đối của mẫu.
SVTH: Ngô Mỹ Yến Trang 38
CBHD: TS.Trần Thanh Thủy Luận văn tốt nghiệp
Phần III:
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN.
3.1. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của
chủng nấm men Saccharomyces. sp2 :
3.1.1. Các đặc điểm hình thái:
Nuôi cấy chủng nấm men Saccharomyces. sp2 trên môi trường
Hansen agar ở nhiệt độ 28-30°C. Sau 3 ngày quan sát đặc điểm hình thái
khuẩn lạc của chủng nấm men trên.
Hoạt hóa chủng nấm men Saccharomyces. sp2 trên máy lắc với chế độ lắc 130 vòng/phút trong 24 giờ. Cho | ml dịch hoạt hóa vào 9 ml! môi
trường Hansen dịch thể, sau 2-3 ngày tiến hành làm tiêu bản giọt ép với dung dịch xanh metyken 0,01% để quan sát hình dang, đo kích thước tế
bào của chủng Saccharomyces. sp2, kết quả nghiên cứu trên 30 mẫu sau đó lấy giá trị trung bình. Kết quả được mô tả trong hình 3.1 và bảng 3.1.
Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng nấm
men Saccharomyces. sp2.
SVTH: Ngô Mỹ Yến Trang 39
CBHD: TS.Trần Thanh Thủy Luận văn tốt nghiệ
Bóng, nhô ở Trơn, không 1,9-3 mm.
giữa . rang cưa.
Hình thái tế bào
Cách sắp Kích Dạng nảy | Ty lệ tế bào | Tỷ lệ tế bào xếp tế bào thước chồi nảy chối chết (%)
BH
đơn lẻ. 4-9 24).
3.1.2. Quan sát khuẩn ty nấm men:
Cay nấm men trên môi trường pepton glucoza(MT9) nuôi ở 25-
30°C sau 3-5 ngày lấy ra quan sát vết cấy dưới kính hiển vi. Kết quả:
khuẩn ty của chủng nấm men Saccharomyces. sp2 là khuẩn ty giả đó là
những tế bào đài xếp nối tiếp nhau. Kết quả này được minh họa trong
hình 3.2.
Hình 3.2: Khuẩn ty của chủng nấm men Saccharomyces. sp2.
SVTH: Ngô Mỹ Yến Trang 40