Chương 2. ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐÓI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.3. PHUONG PHAP NGHIEN CUU
2.3.1. Phương pháp thu và xử li mẫu
Quả bình bát được thu hái tự nhiên vào tháng 9 - 10/2023. Quả được chọn có
màu vàng (chín), không bị sâu, không bị thối rữa. Quả được thu hái trên nhiều cây tại
khu vực xã An Phú Tây, huyện Bình Chánh, Tp Hồ Chí Minh (hình 2.1).
21
Sau khi thu vé, qua bình bát được rửa sạch, đê khô ráo tại phòng thí nghiệm Di truyền - Tiến hóa và tách riêng từng phản.
Thịt quả sau khi tách hạt, được ngâm với dung môi (nước cất và ethanol 96°) theo tỉ lệ 1 g mẫu : 10 ml dung môi dé thu nhận cao chiết (hình 2.2).
Hình 2.2. Thịt bình bát sau khi tách hạt được ngâm với ethanol và nước cất
Hạt bình bát được rửa sạch, sấy khô ở 40 - 50°C (theo gia Mohammad Zahid [22]) và theo doi sự thay đổi về khối lượng. Quá trình sấy kết thúc khi khối lượng hạt không đôi. Phan hạt sau khi được tách vỏ, được nghiên thành bột và được ngâm với
dung môi theo tỉ lệ như trên dé thu nhận cao chiết.
2.3.2. Phương pháp thu nhận cao chiết
Các loại cao chiết trong đề tài được thu nhận theo phương pháp của tác giả
Nguyễn Kim Phi Phụng [23].
Quy trình thu nhận cao chiết như sau:
- Mẫu sau khi được ngâm với dung môi (nước và ethanol 96°) theo tỉ lệ 1 : 10
(đã được trình bày ở mục 2.3.1) trong thời gian 24 giờ; dịch chiết được lọc bằng giấy
22
lọc Whatman từ 2 - 3 lần hoặc li tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút dé loại bỏ cặn.
Dịch chiết qua lọc được đuôi dung môi bằng máy cô quay hoặc bé ôn nhiệt;
- Phần mẫu vật sau khi thu dịch chiết lần I tiếp tục được ngâm với dung môi theo tỉ lệ 1 : 10 trong 24 giờ. Dịch chiết lần 2 được thu nhận và xử lí theo các thao tác
như trên;
- Khối lượng cao chiết sau khi thu nhận được cân đề tiền hành bó trí các nghiệm trong dé tài. Cao chiết được bảo quản ở nhiệt độ 4°C, tránh ánh sáng.
Lưu ý: việc ngâm mẫu với dung môi có thé thực hiện nhiều lần; có thé trộn lẫn các dịch qua lọc với nhau va đuổi dung môi đề thu nhận được lượng cao chiết toi đa.
Trường hợp này, các dịch qua lọc phải được bảo quản ở điều kiện lạnh, tránh sáng.
2.3.3. Phương pháp khao sát kha năng kháng oxy hoá invitro 2.3.3.1. Phương pháp xác định năng lực khử
Các cao chiết trong đề tài được khảo sát năng lực khử ở những nòng độ: 100,
200, 400, 600, 800, 1000 pg/mL. Việc lựa chọn các nông độ này dựa trên được tham khảo theo tài liệu [24]. Bảng 2.4 trình bày cách pha nông độ cao chiết bằng dung dịch
DMSO 2,5%.
Bảng 2.4. Các nồng độ cao chiết khảo sát trong thí nghiệm năng lực khử Nong độ cao chiết | Thể tích stock 1000 pg/mL | Thể tích DMSO 2,5%
Pha stock 1000 pg/mL: 0,01 g cao được bé sung vừa đủ 10 mL DMSO 2.5%
100 pg/mL
200 pe/mL
400 pg/mL
600 g/mL 800 pe/mL 1000 pg/mL
Qui trình thí nghiệm được thực hiện theo công bố của tác giả M. Elmatas năm
2020 với các bước được mô ta qua hình 2.3 [25].
23
Pha loãng cao chiết ImL mẫu ở các Bỏ sung 2,5 mL đệm
băng DMSO 2,5% nông độ khảo sat phosphate pH = 6,6
Bồ sung 2,5 mL U ở nhiệt đồ 50°C Bo sung 2.5 mL
TCA 10% trong 20 phút K;{Fe(CN),] 1%
Li tam 3000
| cae | Pa trong vong 10 2,5 mL. Bồ | B22 | 2,5 mL
| cae | Pa dịch sau li tam nước cat 2 | B22 |
Ghi nhận gia trị OD Do độ hap thụ ở Bồ sung 0,5 mL
(Optical Density) bước sóng 700 nm FeCl, 0.1%
Hình 2.3. Qui trình phương pháp xác định nang lực khử
Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần với chứng âm là dung dịch DMSO 2.5%.
2.3.3.2. Phương pháp bắt gốc tự do DPPH
Cao chiết được pha loãng thành các nòng độ: 100, 500, 1000, 1500, 2000 pg/mL
(bảng 2.5) dựa trên cơ sở của tài liệu tham khảo [26].
Bảng 2.5. Các nồng độ cao chiết khảo sát trong thí nghiệm bắt gốc tự do DPPH
1000 g/mL 500 pL 500 pL 1500 pg/mL 750 pL 250 pL
Qui trình thí nghiệm được thực hiện theo tác gia Jonathan P. Adjimani [27] và
được mô tả qua sơ đồ hình 2.4.
Pha loãng cao chiết 1 mL mẫu ở các Bỏ sung Š mL
băng DMSO 2,5% nông độ khảo sát DPPH 0,08 mM
Ghi nhận giá trị OD Đo độ hắp thụ ở Ủ tránh sáng
(Optical Density) bước sóng 517 nm trong vòng 30 phút
_Xác định tỉ lệ Xây dựng phương trình Xác định nông đô
phan trăm bắt DPPH tương quan ECao
Hình 2.4. Qui trình phương pháp bắt gốc tự do DPPH
Chứng âm trong thí nghiệm là dung dịch DMSO 2.5%. Chứng dương là giá trị
ECsa của acid ascorbic. Giá trị này được xác định bằng cách pha loãng acid ascorbic ở các nồng độ: 5, 10, 15, 20, 25 ug/mL (bảng 2.6) và tiền hành khảo sát kha nang bắt gốc tự đo DPPH theo qui trình ở hình 2.6.
Bang 2.6. Các nồng độ acid ascorbic trong thí nghiệm bắt gốc tự do DPPH
Nong độ Age Age + 4£
acidiascachic Thé tích stock 1000 g/mL Thé tích nước cat
5 pg/mL 10 ug/mL 15 pe/mL
20 g/mL 25 ug/mL
Ti lệ phan trăm bắt gốc tự do DPPH được tinh theo công thức:
DPPH (%) = ODc-ODm ODCc
x 100 (%)
Trong đú: OD. là độ hap thụ bước súng của chứng õm của DMSO; ODằ là độ hap thu bước sóng của mẫu khảo sát. Dựa vào ti lệ phần trăm bắt gốc tự do DPPH đề xây dựng phương trình tương quan, tit đó xác định nồng độ của mẫu thử có khả năng bắt được 50% gốc tự do DPPH (ECs›).
25
2.3.4. Phương pháp định lượng hợp chất hữu cơ
Acid ascorbic (vitamin C) và polysaccharide là hai hợp chất hữu cơ có khả năng kháng oxy hoá tốt [28]. Đây cũng la các hợp chất dé tim thay trong quả của các loại cây, gồm ca các loài cây cùng họ với bình bát [29,30,31]. Vì vậy, đè tài tiền hành xác định ham lượng của hai hợp chất hữu cơ trên dé đánh giá khả năng kháng oxy hoá
của thịt và hạt bình bát
2.3.4.1. Định lượng acid ascorbic bằng phương pháp chuẩn độ iod
Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên khả năng khử của acid ascorbic. Khi iod xuất hiện, acid ascorbic chuyén 2 proton H* ở nhóm —enol cho iod (hình 2.5). Vi vậy, dung dich phức chất màu xanh của iod và hồ tinh bột sẽ bị mat màu khi có mặt acid ascorbic. Hàm lượng acid ascorbic có trong mau tỉ lệ thuận với thẻ tích dung dịch iod dùng dé chuyên màu hồ tinh bột.
CH„OH la
HO—C—H HO—C—H
HO \ oO +l ——> ằ { +2HI
HO O
Ascorbic acid Dehydroascorbic acid
Hình 2.5. Sơ đồ phản ứng của acid ascorbic với iod (theo Ancuta Dinu, 2022) Qui trình chuân độ thực hiện theo tài liệu [32] được trình bày ở hình 2.6.
26
Cân I g cao chiết Hoa tan cao chiết P=. “ Bồ sung 10 | a |
cho vao cốc thuỷ tinh 2mL P=. “ 2% | a | 2%
Thu lay 20 mL địch Khuấy đều va li tâm Bỏ sung nước cắt vừa
sau khi li tõm 3000 vịp trong 10 phỳt đủ dộn thộ tớch Šỉ mL
| aoe | sung | mL Chuan độ | a | Chuan độ đến khi xuất
| aoe | tinh bột 1% iod 0, | a | hién mau xanh nhat
Hình 2.6. Qui trình chuẩn độ acid ascorbic bằng iod
Ham lượng acid ascorbic trong mau được tính theo công thức sau:
Vix V2 x 0,00088 V3xa
Acid ascorbic (%) = x 100 (%) Trong đó:
VI: thé thích dung dịch iod cần dùng đề chuẩn độ (mL).
V2: thể tích dung dịch cao chiết được pha loãng (mL).
V3: thé tích dung dich cao chiết được chuẩn độ (mL).
a: khối lượng cao chiết được hoà tan (g).
2.3.4.2. Dinh lượng polysaccharide
Polysaccharide được định lượng bằng phương pháp phenol — sulfuric, đề xuất
bởi Dubois năm 1956, sau đó được cải biên bởi Gabriela Cuesta (2002) [33,34].
Nguyên tắc: polysaccharide bị phân cắt thành monosaccharide bởi acid sulfuric
đậm đặc. Các monosaccharide phản ứng với phenol tạo dung dịch có màu vàng. Dung
dich này có độ hap thụ ở bước sóng 490 nm. Hàm lượng polysaccharide trong mau được xác định bằng cách thế giá trị OD đo được vào phương trình tương quan của chất chuẩn D— glucose. Các nồng độ chất chuẩn D - glucose dùng để xây dựng đường tương quan trong đề tài đã được trình bày tại bảng 2.3.
Qui trình định lượng polysaccharide thực hiện theo tài liệu [34] được thé hiện ở
hình 2.7.
27
Ghi nhân
| eae? | E==xi Density) | trị OD Do độ | sóng 490 nm H;SO, thụ ở | ae | | ae | sung 2,5 mL dac
Hình 2.7. Qui trình định lượng polysaccharide
2.3.5. Phương pháp xử lí số liệu
Ti lệ phần trăm bắt gốc tự do DPPH được xác định bằng phần mềm Microsoft
Excel 2016.
Giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, sự khác biệt về mặt thông kê, phương trình tương quan, đỏ thị được xử lí bằng phần mềm SPSS 16.0.