Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.2 Phương pháp thí nghiệm
Chủng S.cerevisiae
Tối ưu các điều kiện lên men rượu dâu tằm bằng nấm men tự do
Tối ưu các điều kiện cố định tế bào S.cerevisiae trên táo
Lên men rượu dâu tằm bằng chế phẩm cố định và khảo sát số chu kì tái sử dụng
Kiểm tra các đặc điểm sinh học
Hình 3. 1 Sơ đồ nghiên cứu
38 3.2.2 Phương pháp thí nghiệm
3.2.2.1 Kiểm tra các đặc điểm sinh học của giống
a. Quan sát đại thể
Cấy nấm men trên môi trường MT2, ủ 48 giờ. Quan sát mô tả hình dạng, màu sắc, kích thước khuẩn lạc.
b. Quan sát vi thể
Cấy nấm men trên môi trường MT1, ủ 48giờ.
Nhuộm sinh khối tế bào với xanh methylene. Quan sát trạng thái sống của nấm men dưới kính hiển vi.
Nhuộm sinh khối tế bào với safranin. Quan sát hình dạng tế bào nấm men.
c. Khảo sát quá trình sinh trưởng và phát triển của chủng S.cerevisiae
Nhân giống cấp 1: lấy một vòng que cấy giống cho vào ống nghiệm chứa 10 ml MT1. Tiến hành nuôi ở nhiệt độ phòng, sau 24 giờ thu giống cấp 1.
Nhân giống cấp 2: lấy giống cấp 1 trong ống nghiệm vừa thu được cho vào erlen chứa 100 ml MT1. Tiến hành nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, tốc độ lắc 180 rpm/p.
Lập đường chuẩn: lấy mẫu sau 24 giờ nuôi cấy, pha loãng, tiến hành đo OD và đếm số tế bào nấm men bằng buồng đếm hồng cầu, vẽ đồ thị.
Lập đường cong sinh trưởng: tiến hành lấy mẫu sau mỗi 2 giờ kể từ lúc bắt đầu nhân giống cấp 2, đo mật độ quang ở bước sóng 600 nm, vẽ đồ thị.
Giữ giống: tiến hành cấy chuyền giống sang 5 ống thạch nghiêng chứa môi trường MT2 ủ ở nhiệt độ phòng, trong 48 giờ, sau đó giữ ở 40C.
Sau mỗi 4 tuần cấy chuyền 1 lần.
3.2.2.2. Khảo sát các điều kiện lên men rượu.
Tất cả các thí nghiệm đều được tiến hành trong điều kiện kị khí, kết quả thu được của thí nghiệm trước sẽ là tiền đề cho thí nghiệm sau.
Tiến hành các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện lên men đến khả năng lên men rượu dâu tằm của chủng S.cerevisiae. Chỉ tiêu đánh giá: độ cồn.
Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giống ban đầu (với các giá trị; 3%, 5%, 7%,10%) đến khả năng lên men rượu của chủng S.cerevisiae. Tiến
39
hành lên men dịch dâu tằm có Bx= 20, pH 4 ở nhiệt độ phòng, lấy mẫu sau 7 ngày lên men, đem mẫu đi chưng xác định hàm lượng cồn.
Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của độ Brix (với các giá trị 16;18;20;22) đến khả năng lên men rượu của chủng S.cerevisiae. Tiến hành lên men dịch dâu tằm có pH 4 với tỷ lệ giống tối ưu thu được ở thí nghiệm 1 ở nhiệt độ phòng, lấy mẫu sau 7 ngày lên men, đem mẫu đi chưng xác định hàm lượng cồn.
Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu (với các giá trị 3; 3,5; 4,0; 4,5; 5) đến khả năng lên men rượu của chủng S.cerevisiae.
Tiến hành lên men dịch dâu tằm có độ Brix tối ưu thu được ở thí nghiệm 2, với tỷ lệ giống tối ưu thu được ở thí nghiệm 1, ở nhiệt độ phòng, lấy mẫu sau 7 ngày lên men, đem mẫu đi chưng xác định hàm lượng cồn.
Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men (với các giá trị 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9 ngày) đến khả năng lên men rượu của chủng S.cerevisiae.
Tiến hành lên men dịch dâu tằm có pH tối ưu thu được ở thí nghiệm 3, độ Brix tối ưu thu được ở thí nghiệm 2, với tỷ lệ giống tối ưu thu được ở thí nghiệm 1, lấy mẫu theo ngày, đem mẫu đi chưng xác định hàm lượng cồn.
3.2.2.3 Khảo sát cố định tế bào nấm men trên chất mang táo
Phương pháp cố định :
Nhân giống chủng nấm men trong môi trường MT1 ở nhiệt độ phòng, hiếu khí, 48giờ, 180 rpm/phút. 50 ml canh trường được ly tâm ở tốc độ 5000 rpm/phút trong 10 phút để thu sinh khối.
Táo loại bỏ vỏ và lõi, cắt miếng kích thước 1x1x2 cm, khử trùng bằng H2O2 1% trong 5 phút, rửa lại 2 lần bằng nước cất vô khuẩn.
Bổ sung sinh khối nấm men vào 100 ml môi trường MT1, dùng kẹp vô trùng gắp 30g táo đã xử lý bổ sung vào dịch nấm men, ủ qua đêm. Sau đó loại bỏ dịch lên men, chế phẩm cố định được rửa lại 2 lần bằng dịch lên men.
Thí nghiệm 5: Khảo sát một số loại táo có khả năng cố định nấm men Một số loại táo: Granny Smith, Gala, Fuji… được dùng để khảo sát khả năng cố định nấm men. Tốc độ lắc 120 rpm/phút. Loại táo nào có khả năng cố định tốt nhất sẽ được lựa chọn để khảo sát trong thí nghiệm tiếp theo.
Chỉ tiêu đánh giá: mật độ tế bào/ 1g táo cao nhất, độ bền của táo sau khi cố định tốt nhất.
40
Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng cố định nấm men.
Khảo sát quá trình cố định nấm men với loại táo có khả năng cố định tốt nhất thu được từ thí nghiệm 5 với các tốc độ lắc khác nhau (với các giá trị là 80, 100, 120, 150, 180 rpm/p).
Chỉ tiêu đánh giá: mật độ tế bào/ 1g táo cao nhất.
3.2.2.4 Khảo sát quá trình lên men rượu bằng chế phẩm cố định.
Thí nghiệm 7: Khảo sát số chu kì tái sử dụng chế phẩm cố định
Lên men dịch dâu tằm với các điều kiện tối ưu đã thu được khi lên men bằng tế bào tự do, với lượng chế phẩm cố định được tính toán sao cho mật độ tế bào nấm men / ml dịch lên men tương ứng với khi sử dụng nấm men tự do.
Chế phẩm cố định được rửa 2 lần bằng dịch lên men sau mỗi lần lên men, trước khi sử dụng lên men chu kì tiếp theo.