CHƯƠNG 4. THẢO LUẬN KẾT QUẢ
4.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 1 (PU1)
Hợp chất PU1 thu được dưới dạng tinh thể màu vàng của hợp chất flavonoit. Trên phổ 1H-NMR (Hình 4.1) xuất hiện hai tín hiệu doublet đặc trưng cho hai proton của vòng A tại 6,26 (d, J = 2,0 Hz, H-6) và 6,52 (d, J
= 2,0 Hz, H-8), ba tín hiệu điển hình cho vòng B thế 1,3,4 với tương tác spin hệ ABX tại 7,83 (d, J = 2,0 Hz, H-2’); 6,99 (d, J = 8,5 Hz, H-5’); 7,70 (dd, J = 2,0; 8,5 Hz, H-6’). Những dữ kiện trên cho thấy đây là quercetin với công thức phân tử là C15H10O7. Kết quả phổ khối lượng ESI-MS cũng xuất hiện các pic ion tại m/z 303,1 [M+H]+, 325,0 [M+Na]+ và 300,9 [M-H]- hoàn toàn tương ứng phù hợp với công thức phân tử C15H10O7 (M = 302). Kết quả so sánh các dữ kiện phổ của PU1 với quercetin trong tài liệu [8] hoàn toàn phù hợp cho thấy hợp chất chính là quercetin.
Hình 4.1a. Phổ 1H-NMR của PU1
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
Hình 4.1b. Phổ 1H-NMR của PU1
Hình 4.2. Phổ khối lượng ESI-MS của PU1
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
Bảng 4.1. Kết quả phổ NMR của hợp chất PU1
C Ha, b , J (Hz) Hc* , J (Hz) [8]
6 6,26 d (2,0) 6,18 d (2,0)
8 6,52 d (2,0) 6,40 d (2,0)
2’ 7,83 d (2,0) 7,67 d (2,2)
5’ 6,99 d (8,5) 6,89 d (8,3)
6’ 7,70 dd (2,0; 8,5) 7,53 dd (2,2; 8,6)
a đo trong Acetone, b500 MHz, c đo trong DMSO, *Số liệu phổ của quercetin [8]
O
O
OH OH
OH HO
2
OH
3 5 4
7 9
10
1' 3'
6' 4'
Hình 4.3. Cấu trúc hóa học của PU1 4.2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 2 (PUW1)
Phổ 1H-NMR (Hình 4.4) của PUW1 xuất hiện proton H 7,65 (1H, dd, 8,0; 2,0); 6,89 (1H,d, 8,0) và 7,69 (1H, d, 2,0) với hằng số tương tác J = 8,0 Hz và 2,0 Hz dự đoán sự có mặt của một vòng thơm với các nhóm thế gắn vào vị trí octo, para. Các vị trí còn lại là proton tại vị trí meta, para. Dự kiến vòng thơm có dạng như sau:
X
X X
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
Từ các số liệu phổ 1H-NMR của PUW1 còn quan sát thấy hai tín hiệu doulet tại H 6,23 và 6,42 ppm với hằng số tương tác khá nhỏ (J = 2,0 Hz) chứng tỏ hai proton này có mặt trên vòng thơm và ở vị trí meta.
X
X X
X
Ngoài ra, trên phổ 1H-NMR của PUW1 còn quan sát được tín hiệu của 2 phân tử đường với các giá trị H trong khoảng từ 3,29 đến 5,13 ppm, điểm dễ nhận dạng là proton anome của phân tử đường thứ nhất tại H 5,13 (1H, d, J = 7,5 Hz) và phân tử đường thứ 2 proton H 4,54 (1H, d, J = 1 Hz). Trên phổ
1H-NMR còn quan sát được tín hiệu của nhóm metyl H 1,14 (3H, d, J = 6,5 Hz).
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
Hình 4.4. Phổ 1H-NMR của hợp chất PUW1
Phổ 13C-NMR (Hình 4.5) của hợp chất PUW1 quan sát được 27 tín hiệu cacbon, trong đó có tín hiệu đặc trưng của cacbon anome trong 2 phân tử đường với C 104,72 và 102,42 ppm, các cacbon khác của phân tử đường lần lượt là C 75,73; 78,21; 71,42 ; 77,24 và 68,57 ppm; phân tử đường thứ hai C
72,11; 72,26; 73,95 và 69,71 ppm. Các tín hiệu khác cho thấy sự tồn tại của một vòng thơm có thế 2 vị trí octo, 1 vị trí para và một vòng thơm có thế ở 2 vị trí octo,2 vị trí para.
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
Hình 4.5. Phổ 13C-NMR của hợp chất PUW1
Các tín hiệu lần lượt hai tín hiệu cacbon có tín hiệu cao thể hiện sự đối xứng C 130,87 và 115,09 ppm. Tín hiệu cacbon tại C 179,43 ppm cho thấy đây là một nhóm cacbonyl C=O, các tín hiệu C 158,54; 135,63; 159,35;
166,10; 135,63 ppm, cho phép dự đoán các cacbon này có gắn hoặc nằm cạnh nhóm thế có chứa oxy. Kết hợp các số liệu về phổ 13C-NMR có thể dự đoán các phân mảnh của hợp chất PUW1 như sau:
X
X X
X
X X
X
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
X
O
X
O
X
X
Trên phổ HSQC (Hình 4.6) cho thấy sự tương tác trực tiếp giữa proton và cacbon. Quan sát trên phổ HSQC cho thấy sự tương tác giữa các cặp proton và cacbon tương ứng như sau: C 104,72 và H 5,13 (1H, d, J = 7,5 Hz); 102,42 và H 4,54 (1H, d, J = 1,0 Hz); C 99,98 và H 6,23 (1H, d, J = 2,0 Hz); C 94,89 và H 6,43 (1H, d, J = 2,0 Hz); C 130,87 và H 8,04 (2H, d, J = 9,0 Hz); C 115,09 và H 6,88 (2H, d, J = 9,0 Hz); các cặp tương tác trên phân tử đường C 74,20 và H 3,17*; 77,48 và 3,08*hoặc 69,88 và 3,08*; 76,40 và 3,20*; 60,83 và H 3,32*; 3,56 dd (5,0; 12,0).
Hình 4.6. Phổ HSQC của hợp chất PUW1
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125MHz, CDCl3) được trình bày trên Bảng 4.2.
Bảng 4.2. Số liệu phổ cộng hưởng từ nhân của hợp chất PUW1
C δCa δCb, c δHb, d mult.
(J = Hz)
HMBC (H C) 2 158.52 158.54 -
3 135.62 135.63 - 4 179.44 179.43 - 5 162.98 162.99 -
6 99.95 99.98 6.23 d (2.0) 5, 7, 8, 10
7 166.01 166.10 -
8 94.87 94.89 6.42 d (2.0) 6, 7, 9, 10
9 159.35 159.35 - 10 105.66 105.64 - 1' 123.15 123.15 -
2' 117.69 117.70 7.69 d (2.0) 2, 3', 4', 6' 3' 145.84 145.85 -
4' 149.81 149.81 -
5' 116.06 116.07 6.89 d (8.0) 1', 3', 4' 6' 6' 123.55 123.56 7.65 dd (8.0, 2.0) 2, 2', 4' 3-Glc
1'' 104.69 104.72 5.13 (d, 7.5) 3
2'' 75.74 75.73 3.50e 3'' 78.20 78.21 3.45e 4'' 71.42 71.42 3.29e 5'' 77.25 77.24 3.35e
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
6'' 68.56 68.57 3.42e
3.82 dd (11.0, 1.0) 1''' 6-Rha
1''' 102.42 102.42 4.54 d (1.0) 6''
2''' 72.12 72.11 3.65 dd (1.0, 3.5) 3''' 72.26 72.26 3.55 dd (3.5, 9.5) 4''' 73.94 73.95 3.31e
5''' 69.71 69.71 3.47e
6''' 17.87 17.87 1.14 (d, 6.5) 4''', 5'''
aδC của rutin [9], b Đo trong CD3OD, c125 MHz, d500 MHz, etín hiệu bị che lấp
Trên phổ ESI-MS của hợp chất PUW1 xuất hiện pic ion giả phân tử ở m/z 611 [M+H]+, kết hợp với các số liệu NMR cho thấy hợp chất PUW1 có công thức phân tử là C27H30O16, M = 610.
Sử dụng các số liệu phổ HMBC để liên kết các đơn vị cấu trúc đã dự kiến bằng phổ NMR và ESI-MS, kết quả chỉ ra trên bảng 4.2 và hình 4.7.
Hình 4.7. Phổ HMBC của PUW1
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
Kết hợp với tài liệu đã công bố [9], hợp chất PUW1 được xác định là Quercetin 3-rutinoside còn gọi là Rutin, cấu trúc như sau:
O
O
O OH
HO
OH
2 3 5 4
6 7
8 9
10
1' 2'
3' 4' 5' 6'
OH
O O
OH HO OH
Me O HO
HO
OH
Hình 4.8. Cấu trúc và một số tương tác HMBC của PUW1
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
KẾT LUẬN
1. Bằng các phương pháp sắc ký kết hợp, 2 hợp chất flavonoit đã được phân lập từ dịch chiết Etylaxetate của lá cây Phyllanthus emblica. Các hợp chất đó là: Quercetin (PU1) và Quercetin 3-rutinoside (PUW1)
O
O
OH OH
OH HO
2
OH
3 5 4
7 9
10
1' 3'
6' 4'
Quercetin (PU1)
O
O
O OH
HO
OH
2 3 5 4
6 7
8 9
10
1' 2'
3' 4'
5' 6'
OH
O O
OH HO OH
Me O HO
HO
OH Quercetin 3-rutinoside (PUW1)
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
2. Cấu trúc của các hợp chất này được xác định nhờ vào các phương pháp phổ hiện đại như phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, HSQC và HMBC) và phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI).
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt
[1] Đỗ Huy Bích và cộng sự (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, trang 260-261, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.
[2] Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt nam, Nhà xuất bản Y học.
[3] Nguyễn Hữu Đĩnh, Trần Thị Đà (1999), Ứng dụng một số phương pháp phổ nghiên cứu cấu trúc phân tử, Nxb. Giáo dục, Hà Nội.
[4] Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt nam, Nhà xuất bản trẻ.
[5] GS. TS. Lã Đình Mỡi (chủ biên)(2009), TS.Trần Minh Hợi, TS.Dương Đức Huyến, TS.Trần Huy Thái, TS.Ninh Khắc Bản, Tài nguyên thực vật Việt Nam Những cây chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học, tập II, trang 232-236, Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và công nghệ.
[6] Trần Đình Sơn, Vũ Thị Kim Ngọc, Nguyễn Thị Hồng Điệp, Phan Thanh Hải (2008), Phổ cộng hưởng từ hạt nhân, Quyển I, Nxb. Y học Hà Nội.
[7] Trần Đình Sơn, Vũ Thị Kim Ngọc, Nguyễn Thị Hồng Điệp, Phan Thanh Hải (2008), Phổ cộng hưởng từ hạt nhân, Quyển II, Nxb. Y học Hà Nội.
Tài liệu Tiếng Anh
[8] Chen Chang Shen, Yuan Shiun Chang, Li Kang Ho, 1993, Nuclear magnetic resonance studies of 5,7-dihydroxyflavonoids, Phytochemistry, 34(3), 843-845.
[9] Tong S, Yan J, Chen G, Lou J., 2009 May-Jun, Purification of rutin and nicotiflorin from the flowers of Edgeworthia chrysantha Lindl, by high-speed counter-current chromatography. J Chromatogr Sci.47(5), 341-4.