CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.4 Bố trí thí nghiệm
3.4.1 Thí nghiệm 1: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic từ nguyên liệu cải bẹ muối chua
Mục đích: Tìm ra các dòng vi khuẩn lactic để xác định hoạt tính kháng khuẩn của nó.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành các bước là cấy mẫu, cấy chuyền, tăng sinh và bảo quản vi khuẩn lactic thu được.
(i) Cấy mẫu
Cần tiệt trùng môi trường làm việc (đặc biệt tủ cấy vi sinh) trước khi sử dụng, để tránh sự nhiễm các vi sinh vật lạ vào trong mẫu. Tủ cấy cần được được bật UV trong khoảng 15 phút để tiệt trùng môi trường bên trong tủ, sau đó được sát trùng lại bằng cồn 700 rồi mới sử dụng.
Môi trường sau khi tiệt trùng được làm nguội và sử dụng. Trong quá trình làm nguội môi trường có thể bị đặc, do agar tạo gel ở nhiệt độ khoảng 38 – 400C nên cần chú ý phải giữ cho môi trường không bị đặc trong suốt quá trình đổ đĩa. Nếu môi trường ban đầu ở dạng đặc thì phải đun cách thủy để tan ra hoàn toàn rồi mới sử dụng. Sau đó được đổ ra đĩa petri cho môi trường đặc lại và cấy mẫu.
Đối với nguyên liệu cải bẹ, sau khi mua về cân 10g mẫu trong điều kiện vô trùng, cắt nhỏ và cho vào bình tam giác 90ml nước muối sinh lý đã tiệt trùng. Chuẩn bị trước 5 ống nghiệm thể tích là 10ml có chứa sẵn 9ml nước muối để tiến hành pha loãng mẫu.
Trong quá trình chuẩn bị pha loãng, cần phải lắc đều bình tam giác chứa mẫu, để hệ vi sinh vật bên trong mẫu được phân bố đều vào trong nước muối.
Mẫu được pha loãng tuần tự thành dãy các nồng độ thập phân là 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000, 1/10000. Ở bậc pha loãng đầu tiên thì ta tiến hành lấy 1ml dịch mẫu trong bình tam giác cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối đã được chuẩn bị trước, lắc đều thì ta được bậc pha loãng là 1/10. Mỗi bậc pha loãng tiếp sau được thực hiện tương
Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHƯD Trang 27
tự là lấy 1ml dung dịch có độ pha loãng trước đó cho vào ống nghiệm tương ứng thì sẽ thu được các bậc pha loãng là 1/100, 1/1000, 1/10000 và 1/10000.
Sau đó, dùng pipetman và đầu tip vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 0,1ml dịch chứa giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường trong đĩa thạch MRS chứa 0,5% CaCO3. Nhúng đầu que trải thủy tinh vào cồn 700C, hơ trên ngọn lửa đèn cồn để khử trùng. Để đầu que chang (thanh gạt) nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa. Mở đĩa petri, đặt nhẹ nhàng que trải lên bề mặt thạch của đĩa petri. Dùng đầu thanh gạt xoay, trải đều dịch giống lên bề mặt thạch. Trong khi trải, thực hiện xoay đĩa một vài lần, mỗi lần khoảng 1/2 chu vi đĩa tạo điều kiện cho thanh gạt trải dịch giống đều khắp bề mặt môi trường. Sau đó rút thanh gạt khỏi đĩa, đậy đĩa. Mỗi bậc pha loãng được cấy lặp lại hai lần.
Đĩa được ủ trong tủ ấm chứa CO2 ở nhiệt độ là 370C, thời gian ủ là 48 giờ. Nhưng do nhiệt độ phát triển của vi khuẩn lactic rất tương thích với nhiệt độ môi trường (khoảng 30 – 400C) nên có thể sử dụng bình hút ẩm để ủ. Trong bình có đốt nến nhằm tạo điều kiện yếm khí cho vi khuẩn lactic phát triển. Chỗ tiếp xúc giữa nắp bình và bình sử dụng vazơlin để tránh không khí lọt vào.
Sau khi ủ 48h sẽ thấy xuất hiện ở đĩa những khuẩn lạc có dạng hình tròn nhỏ, màu trắng đục, đồng thời sẽ có một quầng trống xung quanh khuẩn lạc đó thì đó là vi khuẩn lactic. Do vi khuẩn này có khả năng sinh ra acid, acid sẽ tác dụng với CaCO3 đã được pha trong môi trường thạch, nên sẽ làm cho xung quanh khuẩn lạc xuất hiện một vùng trống.
Hình 6: Đĩa sau khi ủ 48 giờ trong điều kiện yếm khí
(ii) Cấy chuyền
Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHƯD Trang 28
Các đĩa sau khi xác định có sự hiện diện của LAB (Lactic Acid Bacteria) tiến hành cấy chuyền để thu được dòng vi khuẩn này mà không có sự hiện diện của các vi khuẩn khác.
Trước tiên, cần tiệt trùng môi trường làm việc theo các bước như cấy chuyền, sau đó mới lấy môi trường đã được nấu chảy đổ ra đĩa petri. Khi môi trường trong đĩa đã đặc và khô, ta tiến hành chia đĩa ra làm tám hoặc làm bốn để có thể tiết kiệm được đĩa, cũng như môi trường nuôi cấy.
Tiếp đó dùng que cấy phải được hơ đỏ, làm nguội và lấy một vòng que cấy đầy hỗn hợp vi sinh vật cần phân lập. Nghiêng hé mở nắp đĩa petri ra dùng que cấy zíc zắc lên các phần môi trường đã được chia.
Que cấy phải được hơ đỏ, làm nguội mới lấy hỗn hợp vi sinh vật tiếp theo cấy lên các phần môi trường kế tiếp. Thực hiện tương tự với các đĩa còn lại. Môi trường sử dụng ở đây là MRS có 1,5% bột agar và 0,5% CaCO3.
Đĩa này cũng được ủ ở nhiệt độ môi trường, có trong bình nến (có thể sử dụng tủ ấm) để tao sự yếm khí, trong thời gian là 24giờ. Nhằm mục đích tách LAB ra khỏi ra khỏi hỗn hợp vi sinh vật trong môi trường cấy mẫu ban đầu.
Hình 7: Đĩa sau khi được cấy chuyền sau khi ủ 24 giờ
(iii) Tăng sinh
Sau thời gian ủ là 24 giờ lấy đĩa ra xem, những khuẩn lạc nào có xuất hiện những vùng trống (clear zone) xung quanh thì lấy khuẩn lạc đó mang đi tăng sinh trong dung dịch MRS. Quá trình tăng sinh cũng được thực hiện trong tủ cấy vi sinh.
Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHƯD Trang 29 Hình 8: Ống nghiệm sau khi tăng sinh
Tủ cấy cũng được tiệt trùng trước khi sử dụng. Sử dụng ống nghiệm để đựng vi khuẩn tăng sinh.
Mục đích của tăng sinh là để cho vi khuẩn phát triển mạnh và tăng nhanh về mật số.
Thao tác được thực hiện như sau: sử dụng que cấy đã được hơ đỏ trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội rồi dùng que cấy để lấy vi khuẩn trong đĩa cho vào ống nghiệm có chứa dung dịch MRS. Các ống nghiệm có chứa vi khuẩn nào cần được ghi số tương ứng với số của vi khuẩn đó ghi trên đĩa.
Sau đó các ống nghiệm được đem đi ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ là 370C trong thời gian là 24 giờ.
(iv) Bảo quản
Đối với chủng vi khuẩn dùng để xác định hoạt tính kháng khuẩn Chuẩn bị dung dịch MRS cho vào trong ống nghiệm 5ml dung dịch.
Sử dụng que cấy (đã được hơ đỏ, để nguội) lấy vi khuẩn từ ống eppendorf và cho vào dung dịch MRS hoặc NB (Nutrition Broth) đã được chuẩn bị ở trên. Sau mỗi lần lấy que cấy cần được hơ đỏ, để nguội rồi mới sử dụng tiếp. Sau đó đem đi ủ ở nhiệt độ tối thích là Lactobacillus sakei TISTR 890, Bacillus coagulans JCM 2257T ở 370C và ở 300C đối với Lactobacillus sakei subsp. sakei JCM 1157T, Lactobacillus plantarum ATCC 14917T.
Chuẩn bị dung dịch glycerol 30% vô trùng (glycerol 30 : nước 70).
Lấy 500àl của dung dịch vi sinh vật đó được nuụi cấy ở trờn vào 500àl của dung dịch glycerol vô trùng cho vào ống eppendorf (đã được tiệt trùng), lắc đều bằng vortex.
Mỗi loài vi sinh vật thực hiện bốn ống. Sau đó được mang đi trữ đông ở nhiệt độ - 200C hoặc -800C. Tất cả các bước trên đều được thực hiện trong tủ cấy vô trùng.
Đối với các chủng LAB thu được
Sau khi được tăng sinh 24 giờ trong tủ ấm, trước khi làm các bước tiếp theo sẽ được trữ lại bảo quản để có thể sử dụng cho các bước tiếp hay các nghiên cứu khác. Các bước được thực hiện tương tự như bảo quản khuẩn chuẩn, cũng lấy 500àl dung dịch
Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHƯD Trang 30
lactic trong ống nghiệm sau khi tăng sinh cho vào eppendorf cú chứa 500àl glycerol vô trùng. Vortex lên để các tế bào vi khuẩn được bao bọc bởi glycerol. Các eppendorf này được đi trữ trong tủ đông ở nhiệt độ -200C.
Các chủng vi khuẩn được sử dụng để kiểm tra đặc tính kháng khuẩn được thể hiện trong bảng 2.
Bảng 2 : Các dòng vi khuẩn dùng kiểm tra tính kháng khuẩn
TSB (Tryptic Soy Broth) chứa 0,6% YE (Yeast extract) Khi cần sử dụng
Lấy mẫu trữ đông ra, rã đông, lắc đều.
Sau đú, lấy khoảng 100 - 200àl cho vào 5ml mụi trường nuụi cấy lỏng (dung dịch MRS) đã được tiệt trùng.
Các vi khuẩn trên được đem đi ủ ở nhiệt độ tối thích đối với vi khuẩn lactic thu được, Lactobacillus sakei TISTR 890, Bacillus coagulans JCM 2257T ở 370C và ở 300C đối với Lactobacillus sakei subsp. sakei JCM 1157T, Lactobacillus plantarum ATCC 14917T trong tủ ấm với thời gian là 24 giờ. Nhằm giúp cho vi khuẩn hoạt động lại sau thời gian trữ đông.
Tiếp tục lấy 200àl, cho vào 5ml mụi trường nuụi cấy lỏng. Đem ủ ở nhiệt độ tối thớch để cho vi khuẩn tăng sinh khối trở lại. Đối với vi khuẩn lactic thu được thu được thì được ủ ở nhiệt độ là 370C.
Tất cả dụng cụ môi trường làm việc đều được khử trùng trước khi sử dụng.