PHẦN III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phân lập nấm mốc trên môi trường có phytate
Tiến hành phân lập các dòng nấm mốc sinh phytase từ các mẫu thức ăn, phân gia cầm, đất... thu thập được.
Phương pháp phân lập:
Ủ các mẫu thu thập trên môi trường M2. M2 là môi trường dinh dưỡng có bổ sung phytase như là nguồn phosphor duy nhất. Vì phytate không tan nên làm cho môi trường M2 có màu trắng đục.
Chỉ những dòng nấm mốc nào có khả năng sử dụng phytate trong môi trường tức là có thể tổng hợp phytase mới có thể phát triển trên môi trường này. Khi tổng hợp phytase hòa tan phytate nên làm cho một vùng môi trường trở nên trong, vùng đó gọi là halo.
Những dòng nấm mốc có khả năng sinh phytase sẽ tạo ra halo lớn, phytase sinh ra càng nhiều thì vùng halo càng lớn. Căn cứ vào kích thước halo này để chọn những dòng nấm mốc sinh nhiều phytase cho các thí nghiệm về sau.
Cấy chuyển từ 3 đến 4 lần trên môi trường M2 nhằm làm cho các dòng nấm mốc đạt độ ròng.
Cấy riêng lẻ các dòng nấm mốc vào môi trường đặc, sau 16h sẽ tiến hành đo kích thướt halo và so sánh với nhau.
3.3.2 Định danh những dòng nấm mốc Sau khi phân lập tiến hành định danh.
Phương pháp:
Ủ các dòng nấm mốc đã phân lập được trên môi trường đặc (M2) tới giai đoạn phát sinh bào tử.
--- Tiến hành quan sát dưới kính hiển vi quang học, căn cứ vào đặc điểm hình thái để nhận diện các chi nấm mốc.
3.3.3 Thí nghiệm đánh giá khả năng hòa tan lân hữu cơ
Chọn 2 dòng nấm mốc tạo halo lớn để tiếp tục nhân giống trong môi trường dịch đậu nành, lắc trong 3 ngày. Sau đó chủng vào hai đối tượng là phân hữu cơ và bột đậu nành (Bảng 8).
Bảng 8: Bố trí thí nghiệm
Nghiệm thức Diễn giải
NT1 (đối
chứng 1) Bột đậu nành với nước cất vô trùng
NT2 Bột đậu nành với dung dịch chứa nấm mốc 1 theo tỉ lệ 3 đậu nành – 1 dung dịch
NT3 Bột đậu nành với dung dịch chứa nấm mốc 2 theo tỉ lệ 3 đậu nành – 1 dung dịch
NT4 (đối
chứng 2) Phân hữu cơ với nước cất vô trùng
NT5 Phân hữu cơ với dung dịch chứa nấm mốc 1 theo tỉ lệ 3 phân – 1 dung dịch
NT6 Phân hữu cơ với dung dịch chứa nấm mốc 2 theo tỉ lệ 3 phân – 1 dung dịch
Cách chủng
Chủng nấm mốc với phân hữu cơ và bột đậu nành theo tỉ lệ 3:1 (3 cơ chất : 1 dung dịch nấm mốc).
Chuẩn bị hộp nhựa hoặc bọc nylon vô trùng. Cân 450g cơ chất và 150ml dịch nấm mốc đã chuẩn bị trước.
Đối với phân hữu cơ cho vào 1 lần đậy kín, ủ trong 20 ngày.
Đối với mẫu đậu nành thì chia đậu nành và dung dich nấm thành 5 phần đều nhau. Cách 2 ngày thêm vào 1 phần. Mỗi lần rải thành 1 lớp đậu nành rồi rưới đều dịch nấm mốc lên bề mặt theo tỉ lệ 3:1 đã nêu. Đậy nấp không kín và ủ cho đến ngày thứ 15 kể từ lần cho đầu tiên.
Khi đó độ ẩm biểu kiến đạt 30%.
Theo dõi các chỉ tiêu: phosphor dễ tiêu (PO4
3-), đạm dễ tiêu, calcium. So sánh các nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn với nghiệm thức đối chứng không có bổ sung vi khuẩn, nếu hàm lượng các chỉ tiêu theo dõi trong các nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn cao hơn nghiệm thức đối chứng (NT3 và NT4) chứng tỏ các dòng nấm mốc có khả năng hòa tan lân hữu cơ hay có khả năng tổng hợp enzyme phytase.
Đối với mẫu phân hữu cơ
Khảo sát chỉ tiêu lân hòa tan bằng phương pháp Oniani
Phương pháp này dựa trên nguyên lý hòa tan các dạng chất photpho trong phân hữu cơ bằng dung dịch H2SO4 0.1N với tỉ lệ 1:25 (1 phân hữu cơ : 25 dung môi), lắc trong 3 phút.
Hàm lượng photpho trong dung dịch được xác định bằng phương pháp trắc quang với “màu xanh molypden”.
Tiến hành:
Cân chính xác 1g phân cho vào ống ly tâm 50ml, thêm vào 25ml H2SO4, dùng tay lắc 1 phút và để yên trong 5 phút.
Dùng pipet hút từ 1-5 ml dung dịch trong cho vào bình định mức 50ml. Thêm vào 20ml nước cất, nhỏ 3 giọt phenolphtalein, dùng NaOH 10% nhỏ từng giọt lắc đều cho tới khi dung dịch có màu hồng nhạt sau đó dùng dung dịch H2SO4 5% nhỏ từ 1 – 2 giọt lắc đều đến khi mất màu. Tiếp tục thêm 8ml dung dịch B để làm hiện màu, lên thể tích bằng nước cất tới vạch và lắc đều, để yên 10 – 20 phút đem đo trên
--- máy so màu ở bước sóng 880nm. (Chuẩn bị mẫu blank giống như thật nhưng không có mẫu phân hữu cơ).
Đường chuẩn: từ dung dịch chuẩn 0,1 mg/ml P2O5, hút lần lượt 1, 2, 3, 4, 5 ml cho vào bình định mức 5ml, thêm vào 20ml nước cất và cho hóa chất làm giống dung dịch trích, đo trên máy đo OD ở bước sóng 880nm.
Cách tính kết quả
P2O5 (mg/1g mẫu khô)= a v 100 k/(%m vi) Trong đó:
a (mg): Số P2O5 tìm đo trên đồ thị
v (ml): Thể tích dung dịch trích P dễ tiêu trong đất Vi (ml): Thể tích dịch trích mang đi so màu
K: hệ số khô kiệt của mẫu.
Đối với mẫu bột đậu nành
Khảo sát các chỉ tiêu protein dễ tiêu bằng phương pháp Kjeldahl, đo lân hòa tan bằng phương pháp so mẫu còn calcium được đo bằng phương pháp ASS.