Chương 2: Vật liệu và phương pháp
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2. 2.1 Các phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA
Bằng thực nghiệm cho thấy, mô của cây Cọc rào chứa tanin và các hợp chất phenol ở mức cao. Khi tế bào bị phá vỡ, các hợp chất này có thể tiếp xúc với nhân và các bào quan khác. Ở dạng oxy hóa, các phenol này liên kết hóa trị với DNA làm chúng có màu nâu, khó nghiên cứu. Để tìm ra một phương pháp tách chiết DNA tối ưu: dễ thực hiện, cho kết quả DNA tinh sạch và nguyên vẹn, chúng tôi tiến hành khảo sát hai quy trình tách chiết DNA trên 5 mẫu Cọc
rào: BT1, BT2, NT1, NT2 và giống nhập từ Ấn Độ.
Quy trình 1: Có sử dụng nitơ lỏng khi nghiền mẫu
DNA của các mẫu Cọc rào được chiết xuất và tinh sạch từ nguồn lá tươi, áp dụng phương pháp CTAB của Steward 1993 [62].
Bước 1: Mẫu lá non tươi được rửa sạch, lắc cồn 70o trong 5 phút và rửa lại bằng nước cất 3 lần.
Bước 2: Nghiền 0,1g – 0,15g lá tươi trong nitơ lỏng trong cối sứ thành bột mịn.
Bước 3: Thêm 0,8ml dung dịch CTAB 2x đã được ủ nóng ở 65oC trong 10 phỳt và trộn đều. Cho hỗn hợp vào ependorf 1,5ml cú sẵn 10àl 0,2% mercaptoethanol, đảo đều. Ủ tiếp ở nhiệt độ này trong 60 phút, đảo đều sau mỗi 15 phút.
Bước 4: Thêm 0,5ml phenol/chloroform (1:1 v/v), đảo đều trong 5-10 phút , sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút.
Bước 5: Cẩn thận chuyển lớp dịch trong bên trên sang tuýp 1,5 ml mới, sau đú thờm 500àl isopropanol lạnh và lắc nhẹ. Ủ ở nhiệt độ -20oC trong 1h hoặc có thể ủ qua đêm.
Bước 6: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút. Hút bỏ dịch nổi, thu cắn.
Thờm 500 àl cồn 80o lạnh, lắc nhẹ.
Bước 7: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút. Hút bỏ dịch nổi, thu cắn, để khô ở nhiệt độ phòng.
Bước 8: Hũa tủa trong 50 àl 0,1x TE. Thờm 1 àl Rnase 1 mg/ml, ủ ở 37oC trong 1 giờ.
Bước 9: DNA tinh sạch được bảo quản ở -20oC đến khi sử dụng.
Quy trình 2: Không sử dụng nitơ lỏng khi nghiền mẫu
DNA của các mẫu Cọc rào được chiết xuất và tinh sạch từ nguồn lá tươi, áp dụng phương pháp CTAB của Keb-Llanes đã được bổ sung 2002 [43].
Bước 1: Mẫu lá non tươi được rửa sạch, lắc cồn 70o trong 5 phút và rửa lại bằng nước cất 3 lần.
Bước 2: Cân khoảng 0,1g – 0,15g lá non, cắt nhỏ cho vào ependorf 1,5ml.
Dùng chày giã nhuyễn.
Bước 3: Thờm vào mẫu 300 àl EBA, 900 àl EBB và 10 àl SDS.
Bước 4: Trộn đều mẫu và ủ 65oC trong 10 phút.
Bước 5: Đặt ependorf trờn đỏ và thờm 410 àl potassium acetate trong 30 phút. Đảo đều hỗn hợp và đặt trở lại trên đá trong 3 phút.
Bước 6: Ly tâm 13200 vòng trong 15 phút (tốt nhất ở nhiệt độ 4oC).
Bước 7: Cẩn thận chuyển 1 ml lớp dịch trong bên trên sang tuýp 1,5 ml mới, sau đú thờm 540 àl isopropanol lạnh. Ủ trong tủ lạnh (- 20oC) trong 20 phút.
Bước 8: Ly tâm 10200 vòng trong 10 phút, hút bỏ dịch nổi, thu cắn. Thêm 500 àl cồn 70 % lạnh (rửa cồn 3 lần). Để khụ nhiệt độ phũng.
Bước 9: Hũa tủa với 600 àl TE. Thờm 60 àl sodium acetate và thờm 360 àl isopropanol lạnh. Ủ trên đá trong 20 phút.
Bước 10: Lặp lại bước 8 và 9 hai lần.
Bước 11: Hũa tủa với 50 àl TE và bảo quản ở -20oC đến khi sử dụng.
2.2.2 Các chỉ tiêu đánh giá sản phẩm DNA thu được sau khi tách chiết DNA thu được từ 2 quá trình tách chiết được so sánh với nhau dựa trên các chỉ tiêu:
Độ tinh sạch và hàm lượng của DNA tách chiết: chỉ tiêu này được xác định bằng cách đo độ hấp thu ánh sáng của các mẫu ở bước sóng 260 nm (OD260nm) và ở bước sóng 280 nm (OD280nm) từ đó tính tỷ số OD260nm / OD280nm để xác định độ tinh sạch của mẫu. Mẫu DNA thu được tinh sạch khi tỷ số này nằm trong khoảng 1,8 – 2,0. Tỉ lệ thấp hơn 1,8 cho thấy mẫu bị nhiễm protein hoặc các chất hấp thụ UV khác. Tỉ lệ cao hơn 2 thì mẫu bị nhiễm chloroform, phenol hoặc RNA và được xử lí lại với ethanol hoặc RNase. Đồng thời cũng ghi nhận hàm lượng của DNA tách chiết.
Độ nguyên vẹn của mẫu DNA thu được: Xác định độ nguyên vẹn của mẫu DNA bằng cách chạy điện di sản phẩm thu được trên gel agarose 1% và so sánh kết quả trên bảng điện di. Mẫu DNA có độ nguyên vẹn cao khi trên bảng điện di xuất hiện một vạch sáng rõ với kích thước lớn.
2.2.3 Thiết lập phản ứng RAPD 2.2.3.1 Chương trình phản ứng RAPD
Dựa trên nguyên tắc cơ bản của phản ứng RAPD đồng thời cùng với việc nghiên cứu tài liệu về phản ứng RAPD trong và ngoài nước, chúng tôi đã tiến hành thiết lập phản ứng RAPD trên máy PCR BioRAP C1000 có quy trình sau:
Bảng 2.3: Chu trình nhiệt trong phản ứng RAPD [32]
Bước Nhiệt độ Thời gian Số chu kì
1. Biến tính 94oC 1 1
2. Gắn mồi
94oC 35oC 72oC
1 2 1
40
3. Kéo dài 72oC 10 1
2.2.3.2 Thành phần phản ứng RAPD
Bảng 2.4: Thành phần phản ứng RAPD [66]
Thành phần Nồng độ cuối cùng
Dung dịch đệm 1X
dNTP 0,2 mM
Mồi 0,8 àM
Mg2+ 2,5 mM
Tag polymerase 0,4 U
Nước cất Đủ 20 àl
2.2.3.3 Tối ưu hóa thành phần phản ứng RAPD
Phản ứng RAPD thực hiện dựa trên sự bắt cặp các mồi ngẫu nhiên xảy ra trong tình trạng không nghiêm ngặt. Do đó, mọi yếu tố đều có ảnh hưởng đến kết quả phản ứng. Vì vậy để có được kết quả RAPD ổn định, các băng sáng và rõ ràng, chúng tôi tiến hành xác định các thành phần tạo ra một phản ứng RAPD cho kết quả tối ưu.
Chúng tôi thực hiện tối ưu các thành phần của phản ứng PCR lần lượt ở nồng độ ở bảng 2.4.
Bảng 2.5: Các thành phần và nồng độ tương ứng tiến hành tối ưu
Thành phần Các nồng độ khảo sát
dNTP 0,2 mM 0,4 Mm 0,6 mM 0,8 mM
Mg++ 1,0 mM 1,5 mM 2,0 mM 2,5 mM
Mồi 0,1 àM 0,4 àM 0,8 àM 0,12 àM
Taq polymerase 0,5 U 1,0 U 1,5 U 2,0 U
DNA 10 ng 20 ng 50 ng 100 ng
Kết quả mỗi phản ứng được tiến hành phân tích bằng điện di trên gel agarose 2% trong dung dịch đệm TAE 1X, hiệu điện thế 80 Voltage trong 60 phút. Sau khi điện di, gel được ngâm trong dung dịch ethidium bromide 10 mg/ml và các vạch sáng được phát hiện dưới đèn UV. Kích thước các vạch sáng được so sánh với thang chuẩn 100 bp.
Kết quả được thực hiện lặp lại nhiều lần trên mỗi khảo sát cho đến khi cho kết quả ổn định , các băng (vạch) rõ, sáng mới tiến hành bước khảo sát tiếp theo.
Dựa trên kết quả tối ưu của phản ứng RAPD-PCR, chúng tôi cũng tiến hành sàng lọc các mồi hữu hiệu cho nghiên cứu.
2.2.4 Phân tích kết quả đa hình từ phản ứng RAPD 2.2.4.1 Phân tích kết quả đa hình của các cá thể Cọc rào
Thiết lập ma trận nhị phân từ kết quả RAPD-PCR với nguyên tắc nhị phân: Với “1” nghĩa là có sự xuất hiện vạch khuếch đại, với “0” là không có vạch khuếch đại. Chỉ các băng rõ, ổn định và lặp lại có kích thước khoảng 200- 2000 bp được dùng trong phân tích dữ liệu. Các vạch không rõ được loại bỏ.
Để hiển thị mối quan hệ di truyền giữa các mẫu khảo sát, 1 sơ đồ hình cây được xây dựng trên chỉ số tương ứng đơn giản SM (Simple Matching coefficient) và xếp nhóm các mẫu theo phương pháp UPGMA (Unweighted Pair-Groug Method with Arithmetic mean) sử dụng phần mềm NTSYS-pc 2.1.
2.2.4.2 Phân tích khoảng cách di truyền giữa ba dòng Cọc rào Bình Thuận, Ninh Thuận và Thành phố Hồ Chí Minh
Ma trận nhị phân được sử dụng để tính các tham số di truyền bằng chương trình POPGENE version 1.31. Các tham số quan tâm là: Hệ số đa dạng
di truyền của dòng (Hs) và của toàn bộ mẫu khảo sát (Ht), mức độ biến động di truyền trong dòng (Hs/Ht) và mức độ khác biệt nhau về di truyền giữa các dòng (Gst) và hệ số dòng chảy gen (Nm). Tất cả các tham số đều được tính theo từng mồi và tính trung bình cho tất cả mồi.
2.2.5 Phương pháp phân tích hàm lượng dầu và thành phần acid béo của hạt Cọc rào
Để xác định được hàm lượng dầu và thành phần acid béo của hạt Cọc Rào, chúng tôi sử dụng nguyên liệu là hạt Cọc rào. Có tất cả 20 mẫu hạt gồm:
19 mẫu hạt Cọc Rào như ở phần trên và mẫu thứ 20 là hạt thu hoạch được từ giống Ấn Độ được trồng tại xã Phước Tuy, huyện Cần Đước, tỉnh Long An, kí hiệu là F1/AĐ (thu thập vào tháng 2 năm 2009) . Hạt thu thập được phơi trong điều kiện khô mát và bảo quản ở 4oC.
2.2.5.3 Phương pháp AOCS Aa 4-38 [49]
Chúng tôi sử dụng phương pháp AOCS Aa 4-38 để xác định hàm lượng dầu hạt Cọc rào.
Nguyên tắc: Dầu được trích li bằng dụng cụ Soxhlet với dung môi là n- hexan. Dung dịch trích li được thu hồi và đuổi n-hexan rồi cân xác định hàm lượng dầu.
Tiến hành:
- Bình cầu của hệ thống Soxhlet được rửa sạch sấy khô, làm nguội trong bình hút ẩm, cho vài hạt đá bọt, xác định khối lượng (M1).
- Nghiền khoảng 50g mẫu đã loại tạp chất, trộn đều mẫu đã nghiền, cân khoảng 10 g mẫu (tùy loại dầu có thể cân nhiều hoặc ít hơn ) vào cốc đã sấy khô và biết trước khối lượng. Sấy ở 103 – 105oC cho đến khi mẫu khô hoàn toàn (trọng lượng không đổi), làm nguội trong bình hút ẩm (độ ẩm khoảng 3%).
- Lấy mẫu đã dược sấy khô cho vào giấy lọc dầu đã được gấp sẵn thành ống. Đặt ống chứa mẫu vào ống thủy tinh của hệ thống Soxhlet dùng n- hexan tráng vài lần sau đó thêm vào cho đủ khoảng 150ml rồi cho vào hệ thống trích li.
- Điều chỉnh nhiệt độ của bếp sao cho tốc độ sôi của giọt dung môi trong ống ngưng tụ xuống ống chứ mẫu ít nhất là 150 giọt/ phút. Thời gian trích li từ 6 – 10h sao cho dầu được trích li hoàn toàn (có thể thử bằng cách nhỏ vài giọt hexan đã trích li dầu lên một tờ giấy lọc, đem hong khôn nếu không có vết mờ trên giấy là được).
- Cẩn thận lấy túi lọc ra, tiếp tục cho dung môi bốc hơi và ngưng tụ ở ống đựng mẫu để tráng sạch dầu còn dính trên ống, lấy bình cầu có chứa dầu đã trích li ra, sấy để đuổi sạch dung môi đến khi không còn mùi của hexan, cho vào bình hút ẩm, sấy nhẹ đến độ ẩm không đổi, xác định khối lượng (M2).
Cách tính:
Hàm lượng dầu được tính : HLD (%) = * 100
Trong đó :
M: khối lượng mẫu
M2: khối lượng bình cầu chứa dầu trích M1: khối lượng bình cầu và đá bọt 2.2.5.4 Phương pháp AOCS Ce 1e-91 [49]
Metyl hóa mẫu theo các bước:
- Lấy 2-3 giọt dầu cho vào bình cầu, cho 2 ml benzen vào bình cầu, thêm vào bình cầu 6ml methanol với một giọt axit sunfuric và vài viên đá bọt.
- Đun sôi mẫu 3 giờ trên bếp cách cát.
- Lấy mẫu ra thêm 10ml hexan, dung dịch tách thành 2 lớp.
- Tiến hành rửa nhiều lần bằng nước, nước cất cho đến khi pH trung hòa.
- Loại bỏ hết nước, lọc qua giấy lọc có muối khan.
- Đuổi hết dung môi.
- Đem mẫu chạy máy sắc ký khí (Gas Chromatography) ra thành phần acid béo của dầu hạt Cọc rào.
Quá trình phân tích hàm lượng dầu và thành phần acid béo được thực hiện tại Viện Nghiên cứu dầu và cây có dầu, 171-175 đường Hàm Nghi – Quận 1, Thành phố Hồ Chí Minh.
M M2 – M1