PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1.3. Máy móc thiết bị
Các máy móc thiết bị dùng trong đề tài thuộc Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Vi sinh- Khoa Công nghệ Sinh học - trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội (Bảng 3.2).
Bảng 3.2. Máy móc và thiết bị dùng trong đề tài
Tên thiết bị Hãng Nước sản xuất
Bể điện di TV50 SCIE- PLAS Anh
Bể ổn nhiệt JSWB - 22T JSR Hàn Quốc
Cân kĩ thuật PB 602 – S METTLER TOLEDO Thuỵ Sỹ
Cân phân tích AB204 – S METTLER TOLEDO Thuỵ Sỹ
Kính hiển vi LEICA DM750 LEICA Trung Quốc
Lò vi sóng EM – G4777S SANYO Nhật Bản
Máy cất nước WSC/4D HAMILTON Anh
Máy đo pH bàn Meter S20 METTLER TOLEDO Thuỵ Sỹ
Máy khuấy từ gia nhiệt ARE VELP Italy
Máy li tâm lạnh thu sinh khối lớn
Centrifure 5810R EPPENDORF
Đức
Máy li tâm lạnh Universal 320R HETTICH Đức
Máy rửa siêu âm S 60 H ELMA Đức
Máy sản xuất đá lạnh FIM 95A EVERMED Italy
Máy ủ ấm eppendorf 1.5 EPPENDORF Đức
Máy vortex ZX3 VELP Italy
Nồi hấp HVE – 50 HYRAYAMA Nhật Bản
Tủ ấm JSBI – 150C JSR Hàn Quốc
Tủ ấm nuôi cấy Memmert 100 - 800 MEMMERT Đức
Tủ cấy vô trùng JSCB – 1500SB JSR Hàn Quốc
Tủ lạnh GN-185SS LG Việt Nam
Tủ lạnh sâu -20ºC DFUD 3744AE OPERON Hàn Quốc
Tủ lạnh sâu -80ºC ULF 240 W PR02 EVERMED Italy
Tủ sấy dụng cụ JSOF – 100 JSR Hàn Quốc
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Phân lập và lây nhiễm nhân tạo 3.2.1.1. Phân lập các chủng nấm mốc
Lấy 1g mẫu quả cà chua, đu đủ, thanh long bị thối hỏng cho vào 99 ml nước cất vô trùng, lắc ở 150vòng/ phút trong 30 phút, để lắng, đem pha loãng lên các nồng độ 10-5 và 10-6. Lấy50 àl dịch đó pha loóng cấy trải trờn lờn đĩa petri chứa mụi trường PDA đặc (nguyên tắc Koch).
Các đĩa petri đã cấy nấm được nuôi ở nhiệt độ 28ºC – 30ºC trong 3 – 4 ngày.
Các khuẩn lạc đã mọc được cấy chuyển và làm thuần bằng phương pháp cấy chấm điểm sang môi trường PDA mới.
3.2.1.2. Giữ giống
Nấm mốc được giữ giống trong thạch nghiêng bằng cách cấy zích zắc trên môi trường PDA trong ống nghiệm thủy tinh, được nuôi ở nhiệt độ 30°C cho đến khi mọc đẹp trước khi được bảo quản ở tủ 4°C. Các mẫu giữ giống được cấy chuyển hàng tháng và được hoạt hóa trước khi nhân giống.
Nấm mốc được giữ giống ở - 80°C trong glycerol 40%. Hệ sợi, bào tử nấm mốc cùng với một ít môi trường nuôi cấy được gảy vào 1 ml glycerol 40% trong ống eppendorf, lắc đều nhẹ và bảo quản trong tủ lạnh -80°C.
3.2.1.3. Phương pháp lây nhiễm nhân tạo
Các chủng nấm mốc đã phân lập và giữ giống được tiến hành lây nhiễm để thử khả năng gây bệnh trên các quả cà chua, đu đủ và thanh long bình thường, không bị bệnh. Quả đu đủ (xanh, ương, chín), quả cà chua (ương, chín), quả thanh long (chín) được rửa bằng NaClO trong 1 phút rồi rửa lại bằng nước cất vô trùng, để khô. Cắt đu đủ thành các miếng mỏng đặt vào đĩa petri. Đặt cả quả cà chua vào cốc đựng đã vô trùng, dùng dao vô trùng rạch tạo vết thương trên vỏ quả (do cà chua có lớp vỏ pectin tương đối dày). Quả thanh long được đặt vào hộp đã vô trùng, dùng dao vô trùng rạch tạo vết thương trên vỏ quả ở ba vị trí khác nhau chia theo dọc quả. Dùng que cấy gạt bào tử nấm, chấm lên trên vỏ quả đu đủ trên đĩa và vết thương đã tạo trên quả cà chua, thanh long. Bọc kín cốc lại, để vào tủ ổn nhiệt 250C và quan sát trong vòng 10 ngày (Anna và cs, 2002).
3.2.2. Định danh sơ bộ bằng quan sát đặc tính hình thái của các chủng nấm mốc
Quan sát đặc điểm hệ khuẩn ty nấm mốc
Nấm mốc, sau khi cấy chuyển sang thạch nghiêng, được tiến hành tạo khuẩn lạc như sau: bào tử nấm từ ống giống được trộn trong 1ml nước cất vô trùng, lắc đều tạo dung dịch huyền phù. Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi nhanh chóng chấm điểm vào mặt thạch ở giữa đĩa petri, tiến hành cấy trên 3 đĩa. Lưu ý không để điểm chấm loang trên mặt thạch. Nấm được ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 300C trong 5 ngày. Quan sát và mô tả đặc điểm khuẩn lạc: kích thước, màu sắc, hình dạng khuẩn lạc, đặc điểm dạng sợi nấm mọc ở trên mặt khuẩn lạc.
Quan sát vi thể nấm mốc
Làm tiêu bản tạm thời để quan sát được đặc điểm của sợi khí sinh, cuống đính bào tử và bào tử (màu sắc, hình dạng). Tiến hành lau cồn cho lam kính và lamen trước khi làm tiêu bản. Cho 1 giọt nước hoặc glycerol 50% hoặc xanh methylen (pha thành 3 dung dịch riêng biệt: dung dịch 1: 0,9 g Na2HPO4 trong 500ml nước cất, dung dịch 2:
13,6 g KH2PO4 trong 500 ml nước cất, dung dịch 3: 0,1 g methylen xanh hòa vào 500 ml nước cất. Hỗn hợp có: 0,25 ml dung dịch 1 + 99,75 ml dung dịch 2 + 100 ml dung dịch 3 (Lương Đức Phẩm, 2004) vào giữa lam kính, lấy 1 lượng nhỏ nấm mốc hòa vào
5 àl nước/ glycerol 50%/xanh methylen cho đều. Đặt lamen nghiờng 1 gúc 45º so với mặt lam kính sau đó thả từ từ để không tạo bọt khí trên tiêu bản. Dùng giấy thấm nước xung quanh lamen. Đem tiêu bản soi dưới kính hiển vi và quan sát.