CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.2.2. Về phương pháp xử lý mẫu trong nuôi tạo tấm biểu mô niêm mạc miệng
cầu cho việc nuôi cấy đạt được hiệu quả, vừa phải giảm thiểu tối đa những tổn thương gây ra cho bệnh nhân. Trong nghiên cứu này chúng tôi đã lựa chọn kích thước mảnh niêm mạc miệng là 8x8mm với phương pháp nuôi tạo bằng dịch treo và 3x3mm với phương pháp nuôi tạo bằng mảnh mô. Khi sử dụng phương pháp nuôi tạo tấm biểu mô bằng dịch treo thì số lượng tế bào cần dùng là lớn hơn nên bắt buộc kích thước mẫu mô trích thủ lớn. Điều này dẫn đến tổn thương lớn, gây đau đớn và thời gian lành vết thương sẽ kéo dài hơn.
3.2.2. Về phương pháp xử lý mẫu trong nuôi tạo tấm biểu mô niêm mạcmiệng miệng
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi chỉ ra rằng kỹ thuật nuôi mảnh mô có nhiều ưu điểm hơn so với kỹ thuật nuôi dịch treo. Trong hầu hết các giai đoạn của quá trình nuôi cấy, nuôi mảnh mô thể hiện là một phương thức nuôi cấy thuận tiện, cách thức xử lý mẫu nhanh, đơn giản, không đòi hỏi nhiều trang thiết bị. Trong khi đó, quy trình nuôi dịch treo phức tạp, tốn kém hơn.
Việc xử lý mẫu niêm mạc miệng bằng enzym với mong muốn loại bỏ bớt các tế bào lớp nông của biểu mô, tạo điều kiện các tế bào gốc và tế bào giàu tiềm năng sinh sản di cư phát triển tạo tấm biểu mô trên nền màng ối. Tuy nhiên, ngoài tác dụng tách tế bào biểu mô, các enzym còn là yếu tố gây độc tế bào, thậm chí gây chết tế bào. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng dispase để xử lý mẫu mô cho cả hai phương pháp nuôi cấy. Với nuôi bằng mảnh mô, thời gian ủ dispase 2,4 UI/ml khoảng 7 phút. Trong khi đó, nuôi bằng dịch treo toàn bộ mảnh vùng rìa phải tiếp xúc với dispase 1,2 UI/ml trong vòng 1 giờ, hoặc có thể hơn. Mặc dù nồng độ enzyme đã được giảm đi một nửa để hạn chế tối đa nguy cơ gây tổn thương tế bào, tuy vậy thời gian xử
lý mẫu với dispase kéo dài trong nuôi dịch treo cũng là một nguy cơ đối với các tế bào cấy ghép lại vào cơ thể người.
Với phương pháp nuôi bằng mảnh mô, mảnh niêm mạc miệng sau khi ủ với dispase sẽ được chuyển qua dung dịch EDTA rồi rửa lại hai lần bằng môi trường nuôi cấy và đặt trực tiếp vào đáy lồng nuôi cấy đã căng màng ối.
Trong khi đó, ở phương pháp nuôi dịch treo, sau thời gian dài ủ dispase sẽ là bước làm rã các tế bào biểu mô thành dạng dịch treo. Tiếp đến, sử dụng máy ly tâm lạnh để ly tâm dịch treo tế bào ở 4oC trong vòng 5 phút. Việc bổ sung thêm môi trường giàu chất dinh dưỡng và hạ nhiệt độ (4oC) trong thời gian ly tâm nhằm mục đích giảm hoạt động chuyển hoá và tăng tỷ lệ sống của tế bào. Sau khi thu được cặn tế bào, đánh tan cặn và thêm môi trường nuôi cấy để pha cặn thành dạng dịch treo. Đếm mật độ tế bào và điều chỉnh mật độ theo mong muốn bằng môi trường nuôi cấy. Sau đó gieo dịch treo vào đáy lồng nuôi cấy. Như vậy, tổng thời gian để xử lý mẫu cho nuôi dịch treo khoảng 2 tiếng. Trong khi đó, với nuôi mảnh mô chỉ khoảng 30 phút.
So sánh nghiên cứu của chúng tôi với một số nhóm nghiên cứu khác trên thế giới,nhận thấy phương pháp sử lý mẫu không hoàn toàn giống nhau. Năm 2007, tác giả Madhira và cộng sự, khi nghiên cứu trên người tình nguyện từ 18 tới 60 tuổi không có tiền sử hút thuốc lá và viêm nhiễm khoang miệng, súc miệng bằng bentadin 3 ngày liền, lấy kích thước miếng niêm mạc miệng là 3x3mm sau khi gây tê tại chỗ. Vị trí lấy mẫu ở niêm mạc má của môi dưới, dưới kính vi phẫu loại bỏ hoàn toàn lớp dưới biểu mô và mô mỡ. Mẫu niêm mạc miệng sau đó được rửa 3 lần với PBS có chứa kháng sinh penicillin, streptomicin, gentamicin, amphotericin. Mảnh mô được cắt nhỏ và đặt vào màng ối đã loại bỏ biểu mô, không sử dụng nền tế bào 3T3, sau đó được nuôi trong môi trường HCE trong đó có chứa MEM và Ham’s F12 với tỉ lệ 1:2 cùng với các yếu tố khác như EGF, insulin, penicillin, streptomicin, amphotericin, gentamicin, 10% huyết thanh bào thai bê trong vòng 3-4 tuần trong điều kiện 370C, 5%CO2.
Trong nghiên cứu của DH. Ma và cộng sự năm 2009, mảnh niêm mạc miệng lấy để nuôi cấy lại có kích thước lớn hơn (6x6mm), mảnh mô được xử
lý với dispase II 1,2UI ở 370C trong vòng 1 giờ, tiếp đó được xử lý bằng trypsin-EDTA ở 370C, cứ 3 phút lại nạo nhẹ miếng mô cuối cùng dung dịch tế bào được hoà với SHEM có 5% huyết thanh bê, dịch tế bào được gieo lên màng ối đã loại bỏ biểu mô, kết thúc nuôi cấy không tiến hành tầng hoá bằng cách cho mẫu tiếp xúc với không khí [15].
Theo Yoshiyuki Satake và cộng sự (2008) kích thước mảnh mô trích thủ là 8mm, mảnh mô được loại bỏ mô liên kết phía dưới sau đó cắt ra thành những mảnh nhỏ, rửa vài lần trong dung dịch PBS không có ion Canxi và Magie để loại bỏ máu và mô mỡ. Các mảnh mô nhỏ được ngâm trong hỗn hợp 1:1 Ham’s F12 và môi trường bổ sung của Eagle với 10% huyết thanh bào thai bò, 5µg/ml gentamicin, 0,25µg/ml amphotericin B. Tế bào lớp đáy được thu hoạch nhờ ngâm trong dung dịch 0,8UI Dispase 40C trong vòng 5 giờ, 0,05% trypsin, 0,53mM EDTA ở nhiệt độ phòng trong vòng 10 phút. Dịch tế bào được rửa và sau đó lọc thông qua lưới nylon để loại mảnh vụn và các mảnh nhỏ của môi trường. Dịch tế bào đáy đơn thuần sẽ được pha và gieo tế bào từ 0,1-0,2 triệu tế bào trên nền màng ối người, có sử dụng 3T3 xử lý bằng mitomycin với mật độ tế bào sợi là 0,02 triệu/cm2, dịch treo được nuôi cấy trong 2 tuần, sau đó kỹ thuật tạo tầng được áp dụng khi chuẩn bị thu hoạch mẫu [32].