CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Quy trình nghiên cứu
Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 32
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình nghiên cứu SELEX
PCR cải biến Thư viện apatmer DNA
ssDNAgắn kết Streptomycin ssDNA không gắn
Chọn dòng
Aptamer ái lực cao Aptamer ái lực thấp
bỏ
SH-Aptamer
KIT xác định Streptomycin Chip nano vàng
Mẫu sữa
Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 33
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình sử dụng KIT điện hóa
2.3.2. Các phương pháp trong sinh học phân tử
Phương pháp PCR, sử dụng enzym cắt, phương pháp tinh sạch, điện di trên gel agarose, phương pháp gắn gen vào vector tách dòng, phương pháp biến nạp plamid vào tế bào E.coli DH5α, phương pháp tách plasmid DNA, phương pháp tạo gắn kết hạt nano vàng với Aptamer, phương pháp tạo vòng kháng khuẩn.
2.3.3. Phương pháp PCR làm giàu thư viện và tạo ssDNA Dư lượng kháng sinh
Đo tổng trở Ủ với aptasensor
Xác định hàm lượng kháng sinh dựa trên
đường chuẩn
KS thật trong sữa = KS đo được: % thu hồi
Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 34
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Thư viện sau khi tổng hợp được nhân lên tạo thư viện thứ cấp bằng phương pháp PCR với cặp mồi ApF2B/ApR2 với tỉ lệ 100/1. Sản phẩm PCR sau đó được xử lý với enzyme lamda exonuclesase loại bỏ sợi đơn phosphoryl hóa đầu 5’ giữ lại các sợi không phosphoryl hóa đầu 5’.Các ssDNA sau đó được sử dụng để tiến hành quá trình sàng lọc SELEX.
2.3.4. Phương pháp sàng lọc aptamer đặc hiệu streptomycin
Quá trình sàng lọc aptamer đặc hiệu streptomycin được thực hiện trên cột có chứa hạt agarose-streptomycin. 50 àl ssDNA (50 ng/μl) được hoà trong 200 àl đệm binding (5 mM MgCl2; 50 mM Tris-HCl pH 7.6; 250 mM NaCl) ủ với phức agarose-streptomycin lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng 2 giờ, chuyển dịch lên cột tinh sạch DNA (QIAgen). Ly tâm, loại dịch, rửa 3 lần với đệm binding có bổ sung 0,1% tween 20. Aptamer liên kết với streptomycin được giải hấp bằng DMSO, và sử dụng làm khuôn cho vòng sàng lọc tiếp theo. Các vòng sàng lọc sau lượng Tween 20 tăng dần lên tới 0,5%. Vòng sàng lọc loại trừ sử dụng hạt agarose không gắn kháng sinh làm đích, thu dịch aptamer không gắn với chất đích.
2.3.5. Tách dòng các aptamer sau sàng lọc
Dịch aptamer thu được sau vòng sàng lọc loại trừ được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR, sản phẩm PCR sau đó được gắn vào vector tách dòng pCR2.1 TOPO, biến nạp và chọn dòng trong vi khuẩn E.coli chủng DH5α.
2.3.6.Chọn dòng aptamer liên kết đặc hiệu với streptomycin
Quá trình chọn dòng aptamer được thực hiện thông qua phản ứng ELISA: Cộng hợp BSA-streptomycin được cố định trên khay, sau đó các dòng aptamer riêng rẽ (đã biotin hóa) được ủ với phức hệ BSA-streptomycin, tiếp đến các aptamer sẽ được nhận biết bởi
Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 35
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
cộng hợp streptavidin-horseradish peroxidase (HRP). Khi cho thêm cơ chất TMB vào phản ứng, enzyme HRP sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu.Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa aptamer với kháng sinh và thông qua cường độ màu mà biết được khả năng liên kết của từng dòng aptamer với kháng sinh đích.
Hình 2.3. Minh họaquá trình chọn dòng các aptamer có khả năng gắn kết với đích 2.3.7.Chuẩn bị aptamer
Aptamer đặc hiệu kháng sinh streptomycin dòng 1 đã chọn dòng, trình tự được lưu trữ trong vector pCR 2.1 Topo. Tiến hành Thiol hóa 5’-DNA aptamer bằng phản ứng khuếch đại PCR bất đối xứng, với cặp mồi
ApF2SH:5’-SH-ATC CGT CAC ACC TGC TCT CAT ATG - 3’ (10 pmol/àl)ApR2: 5’- ATA CGG GAGA CCA ACA CCA AAG CTTC-3’ (0,1 pmol/àl).
Sản phẩm ssDNA aptamer được kiểm tra bằng máy nanodrop 1000 2.3.8.Chế tạo aptasensor
Điện cực vàng chip có đường kính 2 mm đã được xử lý, quét thế vòng tuần hoàn CV trong dung dịch điện li (K4Fe(CN)6 5mM + K3Fe(CN)6 5mM để kiểm tra tính thuận nghịch
Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 36
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
của hệ, các phép đo quét thế vòng tuần hoàn được thực hiện theo chế độ sau: Điện áp: U1
= -0.3V đến U2=0.9V, tốc độ quét v=0.1V/s. Sau đó điện cực vàng chip được nhúng vào 2àM aptamer đặc hiệu streptomycin trong PBS (10 mM, pH 7,4). Sau 2 giờ, cỏc aptamer được hấp thụ trên điện cực vàng, để loại bỏ các aptamer không cố định, tiến hành rửa sạch bằng nước. Đo EIS ở mỗi bước sửa đổi.
2.3.9.Đo điện hóa và phân tích tín hiệu EIS trong buffer
Aptasensor đã được chuẩn bị ở trên, được ủ trong đệm có chứa streptomycin với các nồng độ 50 μg/l, 200 μg/l, 1000 μg/l và 2000 μg/l, ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Sau khi rửa bằng nước sạch để loại bỏ các thành phần không đặc hiệu, tiến hành đo EIS. Tất cả các phép đo điện hóa đều tiến hành trong dung dịch điê ̣n li (K4Fe(CN)6 5mM + K3Fe(CN)6 5mM+ KCl 0,1M). Các phép đo EIS được tiến hành theo chế độ: quét từ 100K-10 mH, biên độ 5 mV, giới hạn trên 100 KH, giới hạn dưới 10 mH. Kết quả EIS của aptasensor đã được ghi lại và phân tích, xây dựng mối tương quan giữa nồng độ kháng sinh và trở kháng 2.3.10.Phát hiện streptomycin trong các mẫu sữa
Thu thập sữa được bán ngoài thị trường, bổ sung kháng sinh streptomycinvới các nồng độ 30 ng/ml, 200 ng/ml, 600 ng/ml. Các mẫu sữa được thu nhận được xử lý trước với trichloroacetic acid, cụ thể như sau:
- Dung dịch 2% trichloroacetic acid được thêm vào mẫu sữa trong ống ly tâm, trộn đều và siêu âm 30 phút.
- Ly tâm 10.000 vòng/phút, trong 8 phút
- Lọc dịch ly tõm qua màng lọc 0,2 àm (Polyvinylidene fluoride- PVDF) để loại bỏ lipid
- Điều chỉnh pH về trung tính (pH = 7,0) bằng NaOH - Bảo quản ở 4oC cho đến khi phân tích điện hóa