CHƯƠNG 2: PHẠM VI, ĐỐI TƯỢNG,THỜI GIAN, NỘI DUNG, CÁCH TIẾP CẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.2. Nhóm phương pháp trong phòng thí nghiệm
2.4.2.3. Phân tích thành phần một số chất trong mẫu thực vật và hình thái giải phẫu của thân, lá, rễ
a) Phân tích thành phần một số chất trong mẫu thực vật
Mẫu thực vật trước và sau thí nghiệm được thu và được sấy khô ở nhiệt độ 70oC trong 24h đến khối lượng không đổi rồi được nghiền thành bột và phân tích hàm lượng các KLN theo các phương pháp trong Bảng 2.5.
b) Làm tiêu bản nghiên cứu hình thái giải phẫu của thân, lá, rễ thực vật
Phương pháp làm tiêu bản và chụp ảnh qua kính hiển vi quang học được thực hiện nhằm hiểu rõ hơn về những đặc điểm cấu tạo của cơ quan sinh dưỡng: thân, rễ, lá và các đặc điểm chung nhất của các loài thực vật thủy sinh, xác định tỷ lệ, cấu tạo của biểu bì, mô mềm vỏ, trụ dẫn...và đặc điểm hình thái ngoài, cấu tạo trong của cơ thể thực vật trong quá trình phát triển và thích nghi với môi trường sống. Mẫu TV trước và sau TN được lấy và được sử dụng làm tiêu bản nghiên cứu hình thái giải phẫu. Những đặc điểm thay đổi sau khi hấp thu lượng lớn chất ô nhiễm đã được quan sát phát hiện.
Bảng 2.5. Các chỉ tiêu phân tích mẫu thực vật và phương pháp phân tích thành phần các chất trong các mô rễ, thân, lá thực vật
STT Chỉ tiêu Đơn Phương pháp phân tích
phân tích vị
1 TN mg/g TCVN 6498:1999 - Xác định tổng nitơ theo phương pháp Kjeldahl cải biên
2 TP mg/g TCVN 8940:2011- Xác định photpho tổng số- Phương pháp so màu
3 Fe mg/g TCVN 8119:2009- Rau quả- Xác định hàm lượng sắt- Phương pháp đo quang dùng 1,10-Phenanthrolin
4 Zn mg/g TCVN 7811-1:2007-Rau quả và sản phẩm rau quả- Xác định hàm lượng kẽm- Phương pháp phân tích cực phổ
* Chuẩn bị mẫu làm tiêu bản hiển vi:
- Cắt mẫu: Vị trí các cơ quan sinh dưỡng thuộc đối tượng nghiên cứu có kích thước trung bình nên phương pháp cắt mỏng mẫu bằng tay được sử dụng. Lát cắt phải đảm bảo vuông góc với trục thẳng của vật cắt. Cách cắt mẫu phải tuỳ thuộc vào bộ phận là rễ, thân hay lá mà có cách cắt cho phù hợp. Đối với lá phải cắt ngang qua mẫu, mỗi mẫu cắt ở hai vị trí đặc trưng: giữa lá và gần cuống lá, các lát cắt đều đi qua gân chính. Đối với thân phải cắt ngang qua vị trí gần điểm sinh trưởng để nghiên cứu cấu tạo sơ cấp của thân và nghiên cứu cấu tạo thứ cấp của thân cây. Đối với rễ cần cắt ngang qua rễ thứ cấp.
- Nhuộm mẫu: Sau khi cắt, mẫu được ngâm vào nước javen trong vòng 15-20 phút để loại hết nội chất của tế bào, được rửa sạch bằng nước cất 2-3 lần rồi ngâm mẫu vào nước có chứa axit axetic (dung dịch axit axetic loãng) trong vòng 3-5 phút để trung hoà hết javen còn lại (nếu không javen sẽ làm mất mầu thuốc nhuộm về sau). Tiếp theo, mẫu được nhuộm đỏ trong dung dịch carmin - phèn chua trong khoảng 30 phút đến 1 giờ rồi được rửa sạch bằng nước cất. Sau đó, lại đem nhuộm lại mẫu trong dung dịch xanh metylen loãng từ 30 giây đến 1 phút.
Riêng đối với tế bào biểu bì lá cần phải sử dụng phương pháp búc biểu bì lá trước khi đem quan sát cấu tạo hiển vi: đun mẫu lá (1 cm2) trong dung dịch HNO3 loãng hay đậm đặc tuỳ mẫu lá thời gian từ 5-10 phút cho đến khi lá có mầu vàng
phần thịt lá bị phân huỷ thì dừng lại. Lấy mẫu lá ra rửa sạch bằng nước đặt vào lam kính và gạt nhẹ để thịt lá rơi đi rồi nhuộm màu bằng xanh metylen sau đó tách hai mẫu biểu bì trên và dưới của lá để quan sát.
* Quan sát mẫu bằng kính hiển vi:
- Sử dụng kính hiển vi quang học để quan sát ở góc độ phóng đại 4x10, 10x10, 40x10.
- Mẫu sau khi được chuẩn bị sẵn sàng thì đưa lên kính quan sát.
* Phương pháp đo trên kính hiển vi quang học:
Nguyên tắc: muốn đo kích thước của một vật kính nhỏ thì không thể đo trực tiếp bằng thước đo chiều dài thông thường mà phải đo gián tiếp. Người ta so sánh kích thước của vật cần đo với một thước đo thị kính đã được lắp thêm vào thị kính của kính hiển vi. Từ giá trị của mỗi khoảng cách trên thước đo này của mỗi độ phóng đại khác nhau đã được tính trước nhờ một thước đo vật kính sẽ suy ra kích thước vật cần đo.
Dựa vào nguyên tắc trên sử dụng trắc vi thị kính là miếng kính tròn có đường kính nhỏ hơn đường kính của ống thị kính. Ở chính giữa của miếng kính này có khắc một thước dài 1 mm và chia ra làm 100 phần bằng nhau, còn trắc vi vật kính giống như một phiến kính thông thường khác kích thước 26 x 76 mm ở chính giữa có một vòng tròn, thước này dài đúng 1mm và được chia ra làm 100 phần bằng nhau.
* Phương pháp chụp ảnh qua kính hiển vi quang học
- Ảnh được chụp qua kính hiển vi quang học Axiokop, máy ảnh kĩ thuật số:
+ Chụp tổng thể ở vật kính nhỏ phần bó dẫn chính sau đó chụp chi tiết bó dẫn để thấy được cách sắp xếp của gỗ và libe.
+ Chụp tổng thể phần thịt lá sau đó chụp chi tiết cấu tạo biểu bì, hạ bì, mụ giậu, mụ xốp, tuyến tiết, cấu tạo của lỗ khí,…
- Chụp tổng thể qua lát cắt ngang thân rồi chụp chi tiết cấu tạo của biểu bì, mô mềm vỏ, bó dẫn sơ cấp (thấy được cách sắp xếp của gỗ và libe), mô mềm ruột...