CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.5 Tiêu chuẩn và phương pháp đánh giá
Kết quả kỹ thuật chẩn đoán, xác định nhiễm HPV bằng PCR và PCR Realtime type Dương tính.
2.3.5.2. Phương pháp đánh giá - Cách lấy bệnh phẩm:
• Bệnh nhân nam: vị trí lấy bệnh phẩm là niệu đạo; dụng cụ là tăm bông vô khuẩn, lấy dịch tiết hoặc mủ, đưa tăm bông sâu trong niệu không đạo 1,5 cm.
• Bệnh nhân nữ: vị trí lấy bệnh phẩm là niệu đạo và CTC, ngoài ra còn lấy ở hai tuyến Skene và hai tuyến Bartholin khi cần thiết; dụng cụ là tăm bông vô khuẩn, lấy dịch hoặc mủ, đưa tăm bông sâu trong niệu đạo, CTC 1,5cm.
Bệnh phẩm trên bệnh nhân có u nhú sinh dục: lấy u nhú bằng kim lancet hoặc dao mổ như kỹ thuật cắt sinh thiết.
• Bệnh phẩm được thu thập tại khoa Sinh học Phân tử và khoa Xét nghiệm, các trung tâm Da liễu tuyến tỉnh. Bệnh phẩm sau khi lấy được bảo quản trong cồn 70%, vận chuyển đến Bệnh viện Phong Da liễu TW Quy hòa.
- Bảo quản và vận chuyển:
• Bảo quản bệnh phẩm: ở điều kiện vô trùng, giữ –20°C, hoặc trong cồn 70% cho đến khi sử dụng để chiết tách DNA.
• Một phần bệnh phẩm là dịch niệu đạo và dịch CTC sẽ được nhuộm soi trực tiếp, nuôi cấy lậu (đối với bệnh nhân đến khám tại Bệnh viện Phong Da liễu TW Quy Hòa)
• Một phần bệnh phẩm là dịch niệu đạo và dịch CTC được sử dụng để chiết tách DNA, làm phản ứng PCR, giải trình tự tìm gen đột biến thuốc của vi khuẩn lậu và định genotype CT.
• Bệnh phẩm là u nhú sinh dục được bảo quản trong cồn 70% trong quá trình vận chuyển để chiết tách DNA sau đó.
- Li trích DNA các tác nhân vi sinh vật có trong bệnh phẩm
• DNA trong tế bào vi khuẩn được chiết tách bằng bộ hoá chất DNAeasy của hãng QIAgen theo quy trình của nhà sản xuất dùng cho bệnh phẩm là dịch cơ thể.
• DNA tổng số sau khi được chiết tách bảo quản –20° C cho đến khi sử dụng.
- Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu:
2.3.5.3 Kỹ thuật chẩn đoán và xác định type HPV:
- PCR phát hiện phân đoạn gen đích L1 xác định nhiễm HPV:
PCR được thực hiện trên máy Gene Amp PCR system 9700.
• Chu kỳ nhiệt: 95° C - 5 phút.
• Giai đoạn biến tính 95° C-30 giây.
• Giai đoạn bắt cặp 60° C-30 giây.
• Giai đoạn kéo dài 72° C-1 phút.
• Thực hiện trong 35 chu kỳ, giữ 72° C-5 phút trước khi kết thúc.
Thành phần phản ứng PCR:
• Nước tinh khiết 15 àl.
• Dung dịch đệm X10 (TaKaRa) chứa Mg2+(20mM) 2,5 àl.
• Hỗn hợp dNTP 2,5mM mỗi loại (TaKaRa) 2,5 àl
• Men chịu nhiệt (Taq-Polymerase- TaKaRa) 1 đơn vị.
• Mồi xuụi (10pmol) l àl, mồi ngược (10pmol) 1 àl.
• DNA li trớch từ mẫu lõm sàng 5àl.
Sử dụng cặp mồi chung cho HPV (consensus primers) là MY09 và MY11 có trình tự: (5’-GCG ACC CAA TGC AAA TTG GT- 3’) và (5’- GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC-3’), khuếch đại 1 đoạn DNA đích có độ dài 450 cặp nucleotid.
- Multiplex PCR xác định type HPV (kỹ thuật được xây dựng theo nghiên cứu của của K.Sotlar) [97]
Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu cho từng type bao gồm các type được gọi là nguy cơ cao là: HPV type 16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 và 68. Các type được gọi là nguy cơ thấp là: HPV type 6-11.
PCR được thực hiện trên máy AB 7500 fast Realtime PCR.
• Chu kỳ nhiệt: Biến tính 94°C-5 phút.
• 10 chu kỳ thăm dò nhiệt độ bắt mồi gồm biến tính 94°C- 30 giây, bắt mồi 65°C- 30 giây và giảm dần 1°C.
• Mỗi chu kỳ, kéo dài 72°C- 30 giây.
• 30 chu kỳ tiếp theo mỗi chu kỳ gồm: thời gian biến tính 94°C-30 giây, bắt mồi 55°C- 30 giây và kéo dài 72°C- 30 giây.
• Giai đoạn hoàn thành 72°C- 7 phút.
Thành phần phản ứng PCR:
• Nước tinh khiết thờm vào vừa đủ 25 àl;.
• Dung dịch đệm X10 (TaKaRa) chứa Mg2+(20mM) 2.5 àl.
• Hỗn hợp dNTP 2.5mM mỗi loại (TaKaRa) 2.5 àl.
• Men chịu nhiệt (Taq-Polymerase- TaKaRa) 1 đơn vị. Mồi xuụi (10pmol) l àl, mồi ngược (10pmol) 1àl.
• Mỗi hỗn hợp PCR dùng 3-4 cặp mồi.
• DNA li trớch từ mẫu lõm sàng 5àl 2.3.5.4 Phương pháp đánh giá:
- Với các xét nghiệm HPV PCR 2.3.6. Quá trình thu thập số liệu
Bước 1: Xin giấy giới thiệu của trường Đại học Kỹ thuật Y-Dược Đà Nẵng.
Bước 2: Đến gặp và xin phép Ban lãnh đạo khoa Bệnh viện Phong Da liễu TW Quy Hòa và Lãnh đạo khoa Sinh học Phân tử nhằm thông qua các hoạt động trong việc tiến hành nghiên cứu đề tài khoa học và xin số liệu về các bệnh nhân có chỉ định xét nghiệm HPV trong thời gian từ tháng 11/2024 đến tháng 11/2025.
Bước 3: Trích xuất kết quả HPV từ máy AB 7500 Fast hoặc từ phần mềm Hsoft trong khoảng thời gian đã chọn làm nghiên cứu.
Bước 4: Trích xuất thông tin bệnh nhân theo kết quả HPV dương tính từ phần mềm Hsoft chuyên sử dụng để quản lý thông tin xét nghiệm.
Bước 5: Nhờ các cộng tác viên thu thập thông tin của các bệnh nhân trên theo phiếu câ u hỏi với các biến số đã lập sẵn.
+ Biến số thông tin chung.
+ Biến số nội dung mục tiêu 1.
+ Biến số nội dung mục tiêu 2.
2.3.7. Phương pháp quản lý, xử lý, phân tích số liệu 2.3.7.1. Phương pháp làm sạch số liệu
- Lọc lại các phiếu có biến không phù hợp, không có số liệu.
- Loại bỏ những phiếu trùng thông tin cùng một người bệnh.
2.3.7.2. Phần mềm nhập liệu, xử lý số liệu: Sử dụng phần mềm Epidata 3.1.
2.3.7.3. Phần mềm phân tích số liệu
- Xử lý số liệu bằng phương pháp thống kê y học trên phần mềm SPSS 20.0.
- Một số thông tin sẽ được thống kê bằng phương pháp thống kê mô tả như tuổi bệnh nhân, thông tin khám bệnh.
2.3.7.4 Các test thống kê phân tích:
2.3.8. Đạo đức nghiên cứu
Một số khía cạnh quan trọng về đạo đức trong nghiên cứu khoa học được cân nhắc trong luận án này:
- Nghiên cứu tuân thủ theo các quy định về đạo đức nghiên cứu của bộ Y tế cũng như của Bệnh viện Phong Da liễu TW Quy Hòa.
- Nghiên cứu này đã được Hội đồng Khoa học Kỹ thuật của nhà trường thông qua và được sự cho phép thực hiện của Bệnh viện Phong Da liễu TW Quy Hòa.
- Nghiên cứu với mục đích phục vụ bệnh nhân, không với mục đích khác.
- Nghiên cứu được thực hiện trên tinh thần tôn trọng bí mật riêng tư và được sự chấp nhận của đối tượng nghiên cứu, đối tượng có quyền từ chối tham gia nghiên cứu này mà không có sự ép buộc nào.
- Tất các các thông tin của người tham gia nghiên cứu được xử lý và công bố dưới hình thức số liệu, không nêu danh cá nhân.