PHẦN 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT
3.2.2. Kỉểm định thành phần hoá học của Trạch ỉả trước và sau khỉ chế biến
3.2.2.1.Định tính các hợp chất chính trong Trạch tả:
Chúng tôi đã tiến hành định tính một số hợp chất chính trong Trạch tả sống, đồng thời với những hợp chất cho phản ứng dương tính thì tiến hành song
song với Trạch tả chế thông qua đó xác định sự có mặt của các hợp chất đó trong Trạch tả chế (xem bảng 2 và bảng 3).
* Định tính saponin:
- Chuẩn bị dịch chiết:
Cân 5 g bột thô Trạch tả vào bình nón. Thêm khoảng 15 ml cồn ethylic 90°. Đun cách thuỷ 5-10 phút. Lọc lấy dịch cồn để làm các phản ứng.
- T iế n h àn h p h ả n ứng:
+ Phản ứng tạo bọt: Cho vài giọt dịch chiết vào 5 ml nước cất trong ống nghiệm, lắc mạnh, thấy xuất hiện cột bọt bền ít nhất trong 15 phút. Phản ứng dương tính.
+ Phản ứng với acid H2S04 đặc.
Lấy 1 ml dịch chiết, thêm vài giọt H2S04 đặc. Thấy xuất hiện màu tím đỏ.
Phản ứng dương tính.
+ Phản ứng với thước thử Vanilin - Acid sunfuric (T.T.l)
Lấy 1 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt T.T.l, đun cách thuỷ 5 phút xuất hiện màu tím đỏ. Phản ứng dương tính.
+ Phản ứng tạo bọt phân biệt: Lấy 2 ống nghiệm 10 ml:
Óng 1: 5 ml dung dịch NaOH 0,1 N, thêm 5 giọt dịch chiết dược liệu.
Ống 2: 5 ml dung dịch HC1 0,1 N, thêm 5 giọt dịch chiết dược liệu.
Lắc mạnh đồng thời cả hai ống trong 1 phút. Kết quả cột bọt ở hai ống bằng nhau. Sơ bộ kết luận saponin thuộc loại saponin triterpenic.
+ Phản ứng Lieberman-Burchardt: lấy 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, cô cách thuỷ đến cạn, thêm 1 ml anhydric acetic, hoà tan cặn. Cho từ từ lml acid H2S04 đặc theo thành ống nghiệm. Lớp phân cách giữa hai lớp chất lỏng có màu tím hồng. Phản ứng dương tính với saponin triterpenic.
+ Phản ứng Rosenthaler: Lấy 1 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt thuốc thử Vanilin 1% trong HC1 đặc, đun cách thuỷ vài phút xuất hiện màu tím hoa cà. Phản ứng dương tính với saponin triterpenic.
Các kết quả định tính được ghi tóm tắt ờ bảng 2.
* Định tính Flavonoid: •
-Chuẩn bị dịch chiết: Cân 2 g bột thô Trạch tả cho vào ống nghiệm, thêm 10 ml cồn ethylic 90°. Đun cách thuỷ sôi vài phút. Lọc nóng. Thu dịch chiết cồn.
-Tiến hành phản ứng:
+ Phản ứng Cyanidin: Lấy 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, thêm một ít bột Mg kim loại, cho vài giọt acid HC1 đặc. Để yên vài phút, màu của dung dịch vẫn không thay đổi. Phản ứng âm tính.
+ Phản ứng với dung dịch kiềm:
Lấy lml dịch chiết cho vào ống nghiệm nhỏ, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%. Không thấy xuất hiện tủa vàng. Phản ứng âm tính.
+ Phản ứng với dung dịch FeCl35%:
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%.
Không thấy xuất hiện màu xanh đen. Phản ứng âm tính.
Kết quả được ghi tóm tắt ở bảng 2.
* Định tính Coumarin:
-Chuẩn bị dịch chiết: Tiến hành như phần định tính Flavonoiđ:
-Tiến hành phản ứng:
4- Phản ứng. mở-đóng vòng lacton: Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch chiết.
Ố n g 1: th ê m 0 ,5 m l d u n g d ịc h N a O H 10% ; ố n g 2: đ ể n g u y ê n .
Đun cả 2 ống đến sôi, để nguội. Quan sát thấy:
Ống 1: có màu vàng đậm và tủa màu vàng; ống 2: trong.
Thêm vào cả 2 ống, mỗi ống 2 ml nước cất, lắc đều, quan sát thấy:
ống 1: trong su ố t; ống 2: có tủa đục.
Acid hoá ống 1 bằng vài giọt acid HC1 đặc, ống 1 lại tủa đục như ống 2.
Phản ứng dương tính.
Kết quả được ghi ở bảng 2.
* Định tính Sterol:
-Chuẩn bị dịch chiết: Lấy lOg bột thô Trạch tả chiết bằng dụiig cụ Soxhlet với dung môi ete dầu hoả. Cất thu hồi ete dầu hoả dưới áp suất giảm thu được cặn. Cặn này đem xà phòng hoá với dung dịch NaOH 2N/cồn 96° bằng cách đun hồi lưu cách thuỷ. Dung dịch thu được đem chiết lại bằng ete dầu hoả. Cất thu hồi ete dầu hoả dưới áp suất giảm thu được hỗn dịch. Hoà tan hỗn dịch này trong CHC13 (dịch A) để làm phản ứng.
-Tiến hành phản ứng:
+ Phản ứng Lieberman-Burchardt:
Lấy 1 ml dịch A cho vào ống nghiệm nhỏ, thêm 1 giọt thuốc thử (gồm 1 ml Anhydric acetic + 1 ml CHCI3 (để lạnh ở 0°C) + 1 giọt acid H2S04 đặc). Thấy xuất hiện màu xanh lục. Phản ứng dương tính.
+ Phản ứng Rosenheim:
Lấy 1 ml dịch A cho vào ống nghiệm nhỏ, thêm vài giọt dung dịch acid tricloacetic 90%. Thấy xuất hiện màu tím hồng. Màu này chuyển sang màu xanh lơ sau 5 phút. Phản ứng dương tính.
+ Phản ứng với Iod và H2S04 đặc:
Cho 1 lượng nhỏ iod vào aciđ H2S04 đặc rồi cho từ từ vào ống nghiệm đã có sẵn 1 ml dịch A. Xuất hiện màu đỏ hồng. Phản ứng dương tính. Các kết quâ được ghi tóm tắt ở bảng 2.
* Định tính tanin:
-Chuẩn bị dịch chiết:
Lấy 2 g bột Trạch tả cho vào ống nghiệm 10 ml. Rồi tiến hành như ở phần định tính ílavonoid.
-Tiến hành phản ứng:
+ Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ thêm khoảng 10 giọt dung dịch FeCl3 5%, thấy dung dịch chuyển sang màu xanh lá. Phản ứng dương tính.
+ Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, thêm vài giọt dung dịch gelatin 1%, thấy xuất hiện tủa màu trắng đục. Phản úng dương tính. Các kết quả được ghi tóm tắt ở bảng 2.
* Định tính alcaloid:
-Chuẩn bị dịch chiết: Cân 5 g bột thô Trạch tả cho vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 15 ml dung dịch H2S04 1 N đun đều đến sôi, để nguội. Lọc vào bình gạn dung tích 100 ml. Kiềm hoá bằng dung dịch amoniăc 6N đến phản ứng kiềm. Lắc với dung môi CHC13 3 lần, mỗi lần 5 ml. Gộp dịch chiết CHCI3. Lắc tiếp với dung dịch H2S04 IN hai lần, mỗi lần 5 ml. Gộp dịch chiết nước lại để làm phản ứng.
-Tiến hành thí nghiệm:
Cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml dịch chiết trên.
Ống 1: Thêm vài giọt thuốc thử Mayer. Không thấy xuất hiện tủa trắng.
Phản ứng âm tính.
Ống 2: Thêm vài giọt thuốc thử Bouchardat. Không thấy xuất hiện tủa nâu. Phản ứng âm tính
Ông 3: Thêm vài giọt thuốc thử Dragendoff. Không thấy xuất hiện tủa vàng. Phản ứng âm tính..
Kết quả được ghi tóm tắt ở bảng 2.
* Định tính đường tự do:
Lấy 2 ml dịch chiết Trạch tả trong cồn etylic 90° cho vào 1 ống nghiệm 10 ml, thêm vài giọt thuốc thử Fehling. Đun cách thuỷ 5-10 phút. Thấy xuất hiện tủa đỏ gạch ở đáy ống nghiệm. Phản ứng dương tính (xem bảng 2). .
* .Định tính chất béo:
Lấy 5 g Trạch tả, chiết bằng dụng cụ Soxhlex với ete dầu hoả, dịch chiết đem cất dưới áp suất giảm, thu được hỗn dịch đặc. Chấm hỗn dịch đặc này lên giấy lọc, để khô thấy xuất hiện vết dầu trên giấy lọc. Phản ứng dương tính (xem bảng 2).
Bảng 2. Kết quả định tính một số nhóm hợp chất chính trong Trạch tả sống
Số
TT N hóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận sơ bộ
-Phản ứng tạo bọt +++
-Phản ứng Lieberrman-Burchardt +++ Có sap onin . 1 Saponin -Phản ứng tạo bọt phân biệt
-Phản ứng với acid H2S 0 4 đặc
+++
+++
Saponin thuộc loại saponin
-Phản ứng với TT1 . +++ triterpenic
-Phản ứng Rosenthaler +++
-Phản ứng Cyanidin -
Khống có Flavonoid 2 Flavonoid -Phản ứng với kiềm
-Phản ứng với dung dịch FeCU 5%
-
3 Coumarin -Phản ứng mở-đóng vòng lacton -Phản ứng diázo hoá
++
+ Có coumarin
4 Sterol
-Phản ứng Lieberman-Burchardt -Phản ứng Rosenheim
-Phản ứng với Iod và H ,S 0 4 đặc
+++
+ ++
Có Sterol
c Tanin -Phản ứng với FeCl, 5% +
Có tanin
J -Phản ứng với dung dịch gelatin 1% ++
6 Alcaloid
-Phản ứng với thuốc thử Mayer -Phản ứng với thuốc thử Bouchardat
'
Không có alcaloid -Phản ứng với thuốc thử Dragendoff -
7 Đường tự do -Phản ứng với thuốc thử Fehling ++ Có đường tự do
8 Chất béo -Để lại vết trên giấy lọc ++ Có chất béo
+ : Phản ứng dương tính ; - : Phản ứng âm tính ++ : Phản ứng dương tính rõ; +++ : Phản ứng dương tính rất rõ Nhận xét:
Qua bảng 2, sơ bộ kết luận trong Trạch tả sống có chưa các nhóm hợp chất Saponin triterpenic, Sterol, coumarin, tanin, chất béo, đường tự do.
Bảng 3. Kết quả định tính một số nhóm hợp chất có trong Trạch tả trước và sau khi chế biến.
M ẫu thử N hóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận sơ bộ
l.T T S
2.TTC3
3.TTC5
4.TTSV
Saponin
-Phản ứng tạo bọt
-Phản ứng Lieberman-Burchardt -Phản ứng tạo bọt phân biệt -Phản ứng với acid H2S 0 4 đặc -Phản ứng với TT1
-Phản ứng Rosenthaler
+++
+++
+++
+++
+++
+++
Có saponin triterpenic
Coumarin -Phản ứng mở-đóng vòng lacton -Phản ứng diazo hoá
++
+
Có coumarin
Sterol
-Phản ứng Lieberman-Burchardt -Phản ứng Rosenheim
-Phản ứng với Iod và H2S 0 4 đặc
+++
+ ++
Có Sterol
Tanin -Phản ứng với FeCl3 5%
-Phản ứng với dung dịch gelatin 1%
+
++ Có tanin
Đường tự do -Phản ứng với thuốc thử Fehling ++ Có đường tự do Chất béo -Để lại vết trên giấy lọc ++ Có chất béo
+ : Phản ứng dương tính ++ : Phản ứng dương tính rõ +++ : Phản ứng dương tính rất rõ
32.2.2. Định lượng thành phần Saponin toàn phần trong Trạch tả sống và một số dạng chế biến
Qua định tính thấy rằng saponin là thành phần cho phản ứng rõ nhất, đồng thời qua các tài liệu tham khảo thấy rằng hợp chất này cũng cho những thông tin quan trọng. Do vậy, chúng tôi đã tiến hành định lượng hợp chất này.
* Quá trình định lượng:
Cân chính xác 20 g bột thô Trạch tả, cho vào túi lọc trong bình Soxhlet, loại chất béo bằng ete dầu hoả trong 8-10 giờ. Sau đó chiết Saponin bằng etanol
80% trong 8-10 giờ. Dịch chiết đem cất thu hồi dung môi etanol dưới áp suất giảm. Dung dịch đậm đặc thu được đem hoà vào 20 ml nước cất, cho vào bình gạn dung tích 100 ml. Chiết saponin nhiều lần bằng n-Butanol bão hoà nước (tới khi dịch chiết n-Butanol cho phản ứng âm tính với thuốc thử Vanilin-Sunfuric).
Gộp dịch chiết n-Butanol. Cất thu hồi n-Butanol dưới áp suất giảm. Thu được cắn đem hoà với 3 ml etanol cho vào một cốc thuỷ tinh dung tích 100 ml đã cân bì sẩn. Tủa saponin bằng 30-40 ml aceton. Thu hồi aceton. Tủa thu được đem sấy ở nhiệt độ 40-60°C tới khối lượng không thay đổi. Đem cân tủa và tính hàm lượng saponin toàn phần theo dược liệu khô. Mỗi mẫu, tiến hành định lượng 3 lần rồi lấy giá trị trung bình. Song song với quá trình trên, tiến hành xác định độ ẩm của bột thô Trạch tả (xem bảng 4).
Tính hàm lượng Saponin toàn phần theo công thức 1.
Quá trình chiết xuất Saponin được tóm tắt ở sơ đồ 1.
Sơ đổ 1. Sơ đồ chiết xuất saponin từ Trạch tả
Chúng tôi đã tiến hành định lượng Saponin toàn phần trong Trạch tả sống, Trạch tả chế với dung dịch muối ãn 3%, 5% và Trạch tả sao vàng. Kết quả được trình bày ở bảng 4.
Bảng 4. Kết quả định lượng Saponin toàn phần trong Trạch tả sống và một số dạng chế (tính theo dược liệu khô).
Số lần định lượng
Mẫu đinh lương
(g)
TTS TTC3 TTC5 TTSV
m(g) a(%) X(%) m(g) a(%) X(%) m(g) a(%) X(%) m(g) a(%) X(%) 1 20 0.274 17.4 1.66 0.300 12.62 1.71 0.315 10.65 1.76 0.247 8.74 1.35 2 20 0.270 17.85 1.64 0.303 15.80 1.79 0.310 13.65 1.79 0.242 10.95 1.34 3 20 0.266 18.00 1.63 0.285 16.92 1.71 0.308 13.45 1.78 0.249 7.00 1.34
TB 1.64 1.74 1.77 1.34
Nhận xét:
-Hàm lượng Saponin toàn phần trung bình trong Trạch tả sống là 1.64%.
-Hàm lượng Saponin toàn phần trong Trạch tả chế với dung dịch muối ăn cao hơn Trạch tả sống: Với dung dịch muối ăn 3%, hàm lượng đó cao hơn 0,1%.
Với dung dịch muối ăn 5%, hàm lượng đó cao hơn 0,13%.
-Hàm lượng Saponin. toàn phần trong Trạch tả trích dung dịch mủối 3%
thấp hơn so với Trạch tả chế dung dịch muối ăn 5%, tuy nhiên mức độ chênh lệch này không đáng kể.
-Với TTSV: hàm lượng Saponin toàn phần thấp hơn so với Trạch tả sống 0,3%.
3.2.2.3.Phân tích Saponin trỉterpenic bằng SKLM:
- Chuẩn bị dịch chấm SKLM: Saponin toàn phần thu được ở phần 3.22.2.
Đem hoà tan trong metanol để chấm SKLM.
- Tiến hành : Dùng bản mỏng Silicagel GF 254 - Merk tráng sẵn. Tiến hành với nhiều hệ dung môi khai triển khác nhau, cuối cùng chúng tôi chọn được hệ CHCI3: MeOH: NH4OH (50: 9: 1) là hệ có khả năng tách tốt nhất.
- Thuốc thử hiện màu: Dung dịch Vanilin - Sunfuric (1 g Vanilin / 100 ml cồn tuyệt đối + 2 ml H2S04 đặc).
- Kết quả: Sau khi phun thuốc thử hiện màu, thấy xuất hiện ít nhất 7 vết được ghi ở hình 1 và bảng 5.
Hình 1 Bảng 5. Rf và màu sắc các vết Saponin
SỐ Vết
R f . 1 0 0
Hiện màu TTS TTC3 TTC5 TTSV
1 5.5 5.5 5.5 5.5 Xanh tím đậm
2 16.6 15.5 18.9 14.4 Lam
3 31.1 32.2 32.2 30.0 Lam
4 53.3 56.Ố 55.5 52.2 Tím đậm 5 61.1 63.3 63.3 60.0 Tím hồng
6 72.2 74.4 72.2 72.2 Lam
7 85.5 87.7 84.4 86.6 Lam
8 93.3 92.2 92.2 Xanh tím