- Máy điện di model 1602A của hãng HP3D (Đức) với detector DAD, kết nối với phần mềm HP chemstation
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu khảo sát tối ưu điều kiện tách β-Lactam
3.1. Nghiên cứu khảo sát tối ưu điều kiện tách β-Lactam
3.1.1. Chọn bước sóng phát hiện chất
Để khảo sát phổ β-Lactam, detector được chọn là UV-Vis. Do các β-Lactam đều là những hợp chất không có mầu, hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại nên chúng tôi sử dụng máy quang phổ UV – 1601PC với khoảng quét phổ là 190 – 400 nm dùng cuvet thạch anh để xác định các bước sóng hấp thụ tối ưu của các chất này. Các chất được pha với nồng độ 10 mg/l trong 25 mM đệm Borat, 100 mM SDS, pH=9. Phổ thu được thể hiện hình 3.1
Các hệ đệm đa axit hay đa bazơ có nhược điểm là có hấp thụ quang trong vùng UV hay UV-VIS gây khó khăn phát hiện chất.Vì thế phải quét phổ các chất đệm, xem xét sóng đo thích hợp để hạn chế ảnh hưởng
Kết quả quét phổ cho ta thấy: các β-Lactam có phổ hấp thụ quang cao nhất ở 198 nm. Chúng tôi chọn bước sóng làm việc là 198 nm cho pic cao và đẹp nhất. Detector sử dụng của máy điện di là detector DAD của hãng HP
3.1.2. Mao quản và xử lý mao quản trước khi tách
Trong kỹ thuật điện di việc sử dụng mao quản silica đường kính trong nhỏ hơn 100 µm sẽ làm mất ảnh hưởng của nhiệt jun sinh ra trong ống mao quản và do vậy mới cho phép áp vào hai đầu mao quản điện thế cao tới 20 – 30kV. Hơn nữa kích thước mao quản sẽ rất thuận lợi khi phân tích những mẫu có hàm lượng nhỏ như mẫu huyết thanh. Tuy nhiên, nếu mao quản có đường kính quá nhỏ thì thể tích mẫu nạp cũng bị giới hạn, điều này lại ảnh hưởng đến độ nhạy phát hiện. Khoảng đường kính trong của mao quản thường là 25 – 150 µm. Tốt nhất nên dùng mao quản có đường kính trong từ 25- 75 µm. Vì mao quản có ID lớn hơn 75 µm thường cho hiệu ứng nhiệt Iun lớn và khó khống chế nhiệt độ mao quản khi điện di. Để phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm loại mao quản chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này có đường kính trong là 50 µm
Chiều dài mao quản cũng là yếu tố quan trọng, vì muốn áp thế cao vào hai đầu mao quản thì chiều dài mao quản phải đủ lớn. Về mặt lý thuyết, thế áp vào mao quản thông thường đảm bảo từ 200 – 600 V/cm là thích hợp. Việc chọn chiều dài mao quản chỉ có tính chất định tính phụ thuộc vào khoảng cách từ lọ mẫu đến detector và từ detector đến lọ đệm và tùy thuộc vào hỗn hợp chất mẫu cần tách. Mao quản của chúng tôi sử dụng là loại mao quản trần, có tổng chiều dài là 64.5cm, chiều dài hiệu lực là 58cm, loại bubble cell (có độ nhạy cao gấp 3 -5 lần so với cell thông thường) của hãng HP. Để tạo flowcell trên mao quản, tại chiều dài 58cm tính từ đầu mao quản loại bỏ lớp poliamit bằng cách đốt nóng một đoạn mao quản dài 2mm. Sau đó dùng giấy mềm tẩm axeton hoặc etanol lau sạch và lắp vào hệ điện di.
Mao quản lần đầu tiên sử dụng được rửa lần lượt với NaOH 1M 10 phút, nước deion 10 phút và rửa với đệm chạy 30 phút. Sau khi chạy từ 3-4 lần thì hoạt hóa lại cột, rửa với NaOH 0.1M 3 phút, nước deion 3 phút và đệm chạy 10 phút.
3.1.3. Chọn phương pháp bơm mẫu
Trong kỹ thuật điện di mao quản có thể đưa vào mao quản bằng ba phương pháp là phương pháp điện động học (electrokinetic), phương pháp thủy động học (hydrodynamic) và phương pháp Xiphong (siphon). Trong đó phương pháp điện động học và thủy động học được dùng rộng rãi Nguyên tắc của phương pháp điện là đặt một thế nhất định trong một thời gian nhất định vào đầu của hai điện cực, một điện cực nhúng trong lọ mẫu và một điện cực kia nhúng trong lọ đệm. Trong khi đó hai đầu của mao quản cũng được nhúng vào hai lọ mẫu và đệm nói trên. Như thế những ion mẫu sẽ di chuyển vào mao quản tạo thành vùng mẫu đầu mao quản. Ion nào có kích thước nhỏ, điện tích lớn sẽ được dẫn vào mao quản nhiều hơn. Trong mẫu nếu có hai chất phân tích có cùng nồng độ nhưng điện tích khác nhau thì lượng ion của những chất này được dẫn vào mao quản khác nhau. Do vậy nồng độ chất phân tích được nạp vào mao quản sẽ khác so với nồng độ mẫu thực. Sự sai khác này sẽ lớn nếu thời gian bơm mẫu dài. Trong thực tế điều này không đáng ngại vì người ta có thể loại trừ bằng cách bơm mẫu trong thời gian ngắn và ở những điều kiện như nhau trong mọi thí nghiệm nghiên cứu, thời gian bơm mẫu ngắn ảnh hưởng đến độ nhạy. Ngoài ra lượng mẫu bơm còn phụ thuộc vào độ dẫn của dung dịch mẫu, đặc biệt ở những mẫu có nồng độ muối cao mà ta không thể biết trước được như những mẫu nước tiểu.
Trong phương pháp bơm mẫu thứ hai là bơm mẫu theo kiểu thủy động lực học bao gồm trong kiểu bơm mẫu này là bơm bằng áp suất hoặc xiphong. Nguyên tắc của phương pháp xiphong dựa trên sự chênh lệch độ cao của hai đầu ống mao quản được đặt cao thấp khác nhau một khoảng ∆H, một đầu nhúng vào lọ chứa mẫu và đầu kia nhúng vào lọ chứa đệm để mẫu tự xiphong vào ống mao quản trong thời gian nhất định. Như thế mẫu nạp vào được đặt ở đầu mao quản cao. Phương pháp này đơn giản nhưng khi
nạp một lượng mẫu nhỏ cỡ vài nl thì khó chính xác và áp dụng cho những hệ điện di tự tạo đơn giản, độ lặp lại kém. Vì vậy ít được dùng.
Phương pháp bơm mẫu bằng áp suất là dùng một áp suất thích hợp để nén vào lọ chứa mẫu và tạo chân không phía đầu kia mao quản trong một thời gian nhất định. Do lực áp suất đẩy và hút mà một lượng mẫu sẽ được bơm vào đầu mao quản. Áp suất hay được dùng từ 50 – 300 mbar. Mẫu được bơm vào sẽ có nồng độ đều và giống với nồng độ của chất tan trong mẫu phân tích. Trong phương pháp này chúng tôi chọn bơm mẫu theo phương pháp thủy động lực học với áp suất là 50 mbar và cách bơm mẫu này sẽ được dùng trong suốt quá trình thí nghiệm
3.1.4. Độ điện di và độ điện di hiệu dụng
Trong kỹ thuật MEKC chất tạo Mixen có vai trò rất quan trọng, nó quyết định đến độ phân giải của quá trình tách. Các hạt Mixen hình thành trong dung dịch điện di đóng vai trò như pha tĩnh giả. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dung loại Natri dodecyl sunphat (SDS), tức là Mixen được hình thành bởi các phân tử SDS.
Theo lý thuyết, độ điện di [7,8]
µtot(i) = ( µef + µEOF) = l/(ti .E) = (L.l)/(ti .V) (14)
Thời gian lưu của chất tan i là: