3.2. Kết quả làm giàu vi khuẩn điện hóa
3.2.2. Các kết quả phân tích quần xã VSV ở điện cực đáy - anode
3.2.2.1. Kết quả phân tích hệ VSV ở anode đáy bằng các phương pháp truyền thống
Để tìm hiểu thành phần và tính đa dạng của quần xã vi khuẩn ở điện cực đáy của SBES nhằm đánh giá hoạt động của hệ, bước đầu tiên chúng tôi sử dụng các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật cổ điển để phân tích các quần xã vi khuẩn. Các quần xã vi khuẩn có trong các mẫu bùn từ nguồn tự nhiên ban đầu, và từ dưới đáy của hai bể thí nghiệm sẽ được nuôi cấy trong môi trường LB – là một loại môi trường cơ bản giàu chất dinh dưỡng và cho phép nhiều loại vi khuẩn phát triển – với nồng độ NaCl là 1,5 % (để phù hợp với các vi khuẩn nước lợ).
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44
I (mA)
Dòng điện từ các quần xã bùn của các bể thí nghiệm
Qxã TN Qxã ĐC
Phút
48
Hình 3.4: Ảnh các khuẩn lạc thu được trên LB 1,5% NaCl ở nồng độ pha loãng 10-3 Chú thích: A - Quần xã vi khuẩn từ nguồn bùn tự nhiên ban đầu, B – quần xã vi khuẩn từ điện cực đáy của SBES, C – quần xã vi khuẩn đáy của bể đối chứng.
Số lượng các vi khuẩn hiếu khí thu được sau khi phân lập của các quần xã trước và sau khi làm giàu, của quần xã có và không có đặt điện cực được thể hiện trong bảng 3.1.
Bảng 3.1: Số lượng các vi khuẩn thu được sau phân lập bằng LB agar 1,5%NaCl
Quần xã (cfu/g) Số lượng vi khuẩn Quần xã bùn tự nhiên ban đầu 2,63 x 106
Quần xã của điện cực đáy 2,71 x 106 Quần xã của bể đối chứng 3,9 x 105
Xác suất xuất hiện của mỗi chủng vi khuẩn sẽ được tính toán dựa trên tổng số lượng của chúng trên mỗi nồng độ pha loãng trên tổng số tế bào của mỗi quần xã. Với mỗi quần xã chúng tôi thu được từ 20 -21 chủng khác nhau về hình dạng, kích thước, màu sắc và số lượng (Hình 3.4). Tất nhiên các kết quả phân lập bằng phương pháp truyền thống này sẽ không thể phản ánh được đầy đủ thành phần và
A B C
49
tính đa dạng của quần xã vi sinh vật [60]. Tuy nhiên, chúng cũng phần nào cung cấp cái nhìn sơ bộ về sự giống, khác nhau về thành phần vi khuẩn giữa các quần xã.
Kết quả phân tích hình thái khuẩn lạc và tế bào cho thấy mức độ tương đồng giữa các quần xã dùng để nghiên cứu là thấp (Hình 3.7). Chỉ thấy được một số chủng tương đồng giữa quần xã bùn tự nhiên (INO) và quần xã bùn ở điện cực đáy (BTN) hoặc giữa quần xã bùn tự nhiên và quần xã bùn đáy bể đối chứng (BĐC) (Hình 3.7). Cụ thể: ba chủng (I4, I5 và I15) của INO có sự tương đồng với các chủng tương ứng (T10, T4 và T1) của BTN. Ba chủng khác của quần xã bùn tự nhiên ( I1, I18, I21) có sự tương đồng với ba chủng tương ứng của BĐC là (Đ3, Đ20, Đ5). Trong khi đó, có sự khác nhau rõ ràng giữa quần xã điện cực đáy của SBES và quần xã đối chứng: chỉ có một chủng T11 được tìm thấy ở BTN tương ứng với Đ10 trong BĐC. Điều này, phản ánh ảnh hưởng của điện cực tới việc phân hóa thành phần các loài trong quần xã vi khuẩn sau khi làm giàu.
Đáng chú ý, hai chủng I4 và I5 phân lập từ quần xã bùn tự nhiên xuất hiện với tần số rất thấp (cả I4 và I5 chiếm 2,28%) nhưng lại xuất hiện với tần số tương đối cao hơn trong quần xã làm giàu ở SBES: T10 (10,66 %) và T4 (40,07%), tương ứng (Hình 3.5 và 3.7 ). Những vi khuẩn này có thể đã thích nghi tốt hơn với điều kiện anode của SBES và phát triển ưu thế hơn các chủng khác. Trong khi đó, các chủng chiếm ưu thế của quần xã đối chứng ở bể không đặt điện cực lại là Đ1(30,26%) và Đ14 (31, 03%), là các chủng dường như không xuất hiện ở INO và BTN trong kết quả phân lập (Hình 3.5 và 3.7).
50
Hình 3.5: Các chủng phân lập từ 3 quần xã vi khuẩn
Ghi chú: Các mảnh tách rời là các chủng cần quan tâm khi nghiên cứu thành phần quần xã.
1.52%
1.14%
4.18%
2.28%
I4 2.28%
I5
1.14%
22.81%
4.18%
3.80%
0.76%
2.66%
0.38%
2.28%
1.90%
16.35%
4.18%
6.08%
18.25%
1.90%
1.14%
0.76%
A - Phần trăm xác suất xuất hiện các chủng phân lập được từ quần xã
nguồn cấy I1
I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10 I11 I12 I13 I14 I15 I16 I17 I18 I19 I20 I21
3.68%
1.47%1.10%
40.07%
T4
0.37%
1.10%
1.10%
1.84%
8.09%
10.66%
T10
1.10%
3.31%
0.37%
0.74%
2.21%
10.66%
9.93%
0.74%
0.37% 0.74%
0.37%
B - Phần trăm xác suất xuất hiện các chủng phân lập được từ quần xã dưới điện cực anode của hệ SBES
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14 T15 T16 T17 T18 T19 T20 T21
30.26% Đ1
0.77%
0.51%
0.26%
0.51%
10.26%
0.51%
3.59%
1.28%
1.03%
1.03%
4.36%
1.79%
31.03%
Đ14
2.56%
7.18%
0.51%
0.51%
0.51%
1.54%
C - Phần trăm xác suất xuất hiện các chủng phân lập được từ quần
xã bể đối chứng
Đ1 Đ2 Đ3 Đ4 Đ5 Đ6 Đ7 Đ8 Đ9 Đ10 Đ11 Đ12 Đ13 Đ14 Đ15 Đ16 Đ17 Đ18 Đ19 Đ20
51
Hình 3.6: Khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng cần quan tâm.
Ghi chú: - I4, I5 các chủng của quần xã bùn tự nhiên; T4, T10 – các chủng của quần xã SBES; Đ1 và Đ14 các chủng chiếm ưu thế của quần xã đối chứng; I4 và
T10, I5 và T4 là các chủng có hình thái khuẩn lạc và tế bào giống nhau.; Đ1 và Đ14 là các chủng chiếm ưu thế của quần xã đối chứng
Khuẩn lạc: hình tròn, bề mặt nhăn, màu trắng đục.
Tế bào: dạng que.
Gram: âm.
Khuẩn lạc: hình tròn, bề mặt nhăn, màu trắng đục
Tế bào hình que.
Gram âm.
Khuẩn lạc: tròn, trắng đục, mặt nổi, có nhân.
Tế bào: dạng cầu.
Gram: âm.
Khuẩn lạc: tròn, trắng đục, mặt nổi, có nhân
Tế bào hình cầu Gram âm.
Khuẩn lạc: bề mặt phẳng, nhầy, màu trắng sáng.
Tế bào hình que.
Gram âm.
Khuẩn lạc hình tròn, dạng gối, trắng sáng.
Tế bào hình que.
Gram âm.
T10 I4
I5 T4
Đ14 4 Đ1
52
Hình 3.7: Tương quan giữa các quần xã nghiên cứu
Ghi chú:INO: quần xã vi khuẩn của bùn tự nhiên ban đầu; BTN: quần xã vi khuẩn anode của SBES; BĐC: quần xã vi khuẩn bùn bể đối chứng không đặt
điện cực sau 15 ngày kể từ ngày làm giàu. Các màu sắc tương tự không có ý nghĩa các chủng phân lập được là giống nhau. Mỗi mũi tên chỉ ra hai chủng
giống nhau về khuẩn lạc và hình thái tế bào.
1.52 3.69
30.26
4.18 1.11
0.51
2.28
40.22
0.26
2.28
0.37
0.51
1.14
1.11
10.26
22.81
1.11
0.51 4.18
1.85
3.59 3.80
8.12
1.28 10.70
2.66
1.11
1.03 0.38
3.32
4.36 2.28
0.37
1.79 1.90
0.74
31.03
16.35
2.21
2.56
4.18
10.70
7.18
6.08
9.96
0.51
18.25
0.74 0.51
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
INO BTN BĐC
Tỉ lệ phần trăm các chủng phân lập được
21 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 Sự tương đồng của các quần xã nghiên cứu
Isolates
53
3.2.2.2. Kết quả phân tích trình tự gen 16S rRNA của các đơn chủng chiếm ưu thế trong các quần xã vi khuẩn cần quan tâm
Hình 3.8: Kết quả khuếch đại trình tự gen 16S rRNA của các đơn chủng với cặp mồi P63F và P1378R từ sản phẩm tách DNA tổng số
Để so sánh các trình tự một cách chính xác hơn, chúng tôi khuếch đại trình tự gen16S rRNA của các đơn chủng với cặp mồi P63F và P1375R từ sản phẩm tách DNA. Các kết quả ở Hình 3.8 cho thấy, trình tự gen 16S rRNA của các đơn chủng đã được khuếch đại thành công với cặp mồi P63F và P1378R từ sản phẩm DNA tổng số. Các mẫu này sau đó được giải trình tự và các trình tự thu được được tiến hành phân tích bằng công cụ BLAST.
Các kết quả phân tích trình tự 16S RNA cho thấy sự trùng khớp với các kết quả phân lập về mặt hình thái (Bảng 3.2). Trong đó, các chủng I4 và I5 có đặc điểm giống các chủng tương ứng T10 và T4. Các chủng I4 và T10 được xác định là Pseudomonas sp. thuộc chi Pseudomonas. Các chủng này chỉ chiếm 2,28%
trong số các khuẩn lạc phân lập được của quần xã bùn tự nhiên ban đầu nhưng lại có tần số xuất hiện cao hơn trong quần xã anode của SBES, có lẽ là kết quả của việc làm giàu. Các chi Pseudomonas đã được biết đến là nhóm vi khuẩn có tiềm năng thích ứng về mặt di truyền và trao đổi chất đa dạng [83]. Sự có mặt của Pseudomonas sp. trong các hệ thống sinh điện hóa cũng đã được đề cập trong các nghiên cứu trước đây [93, 96].
54
Bảng 3.2: Kết quả phân tích các trình tự 16S RNA của các đơn chủng quan tâm
Tên chủng Loài Hệ số tương đồng
I4 Pseudomonas mendocina 99%
Pseudomonas pseudoalcaligenes 99%
Pseudomonas composti 99%
Pseudomonas citronellolis 99%
Pseudomonas oleovorans 99%
Pseudomonas nitroreducens 99%
I5 Vibrio parahaemolyticus 99%
Vibrio diabolicus 99%
Vibrio alginolyticus 99%
Vibrio azureus 99%
T4 Vibrio parahaemolyticus 100%
Vibrio alginolyticus 100%
Vibrio neocaledonicus 100%
T10 Pseudomonas xanthomarina 99%
Đ1 Photobacterium halotolerans 99%
Đ14 Microbulbifer pacificus 99%
55
Các nhà nghiên cứu tại Đại học Ghent (Bỉ) cũng phát hiện một số vi khuẩn trong anode của MFC, kể cả Pseudomonas sp. mà có thể tạo ra chất trung gian để chuyển các electron vào các điện cực [96]. Nghiên cứu của chúng tôi tiến hành với mục đích làm giàu thêm các vi khuẩn điện hóa chịu lợ thích nghi với điều kiện anode của SBES. Có thể thấy các Pseudomonas sp. của SBES (Bảng 3.2) có liên quan chặt chẽ đến các nhóm Pseudomonas ưa và chịu mặn như P.
mendocina hoặc P. xanthomarina. Do đó, có thể dự đoán rằng Pseudomonas sp.
này là một vi khuẩn ưa mặn có vai trò quan trọng trong quần xã vi khuẩn điện hóa của SBES.
Các kết quả từ Bảng 3.2 cũng cho thấy các vi khuẩn Vibrio sp. cũng có mặt trong anode của SBES với tỉ lệ 40% trong khi chỉ chiếm 2,28% trong quần xã của nguồn bùn tự nhiên ban đầu. Điều này là do các mẫu bùn ban đầu được lấy từ các ao nuôi trồng thủy sản nước lợ trong thực tế đã có sẵn các vi khuẩn này, và khi đặt vào hệ thống SBES của chúng tôi được vận hành mô phỏng nước đang ô nhiễm các vi khuẩn này có điều kiện phát triển và trở nên có mặt nhiều hơn. Hầu như tất cả các loài Vibrio là vi khuẩn kỵ khí tuỳ tiện và chúng thường gây bệnh ở thủy sản, đặc biệt là cá nước mặn, tôm bởi vì hầu hết các vi khuẩn Vibrio sống trong môi trường biển. Câu hỏi được đặt ra là liệu các loài Vibrio đóng vai trò gì trong quá trình sinh điện của SBES. Nếu các Vibrio có khả năng ảnh hưởng đến khả năng sinh điện của hệ SBES thì hiện nay, chưa có nghiên cứu nào đề cập đến vấn đề này.
Sự hiện diện của hai chủng chiếm ưu thế trong quần xã bể đối chứng, Đ1 và Đ14 được xác định lần lượt là Photobacterium halotolerans và Microbulbifer pacificus, là hợp lý và phù hợp bởi vì chúng được bắt nguồn từ nơi có nồng độ muối cao. Vi khuẩn Photobacterium halotolerans là một loài mới được phân lập từ một hồ nước muối nằm ở Mallorca, Tây Ban Nha [82]
và Microbulbifer pacificus là một loài mới được phân lập từ mẫu bọt biển từ Thái Bình Dương [36].
56
3.2.2.3. Kết quả phân tích DGGE các quần xã vi khuẩn
Khuếch đại gen 16S rRNA: Kết quả PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA có kích thước 1400bp của đơn chủng (Hình 3.8) và đa chủng (Hình 3.9) và đoạn DNA có kích thước 200bp (Hình 3.10) sử dụng cho điện di DGGE cho thấy sản phẩm PCR đặc hiệu.
Hình 3.9: Kết quả khuếch đại trình tự gen 16S rRNA của các mẫu với cặp mồi P63F và P1378R từ sản phẩm tách DNA tổng số.
Trong đó: A: Các mẫu đa chủng, B: Các mẫu đơn chủng
Hình 3.10: Kết quả PCR khuếch đại trình tự gen 16S rRNA dùng cho phân tích DGGE bằng cặp mồi (P338F & P518R).
Trong đó: A: Các mẫu đa chủng, B: Các mẫu đơn chủng
Sản phẩm PCR đoạn DNA kích thước 200 bp (có GC-clamp) sau đó được phân tích bằng phương pháp PCR - DGGE.
57
Kết quả DGGE
Kết quả điện di DGGE (Hình 3.14) cho thấy sự khác nhau rõ rệt giữa các quần xã vi khuẩn được nghiên cứu.
Hình 3.11: Kết quả điện di DGGE quần xã anode của SBES và các đơn chủng chiếm ưu thế
Ghi chú: ĐC -: đối chứng âm; I4, I5, T4, T10, Đ1, Đ14: các đơn chủng;
INO, TN, ĐC: lần lượt là các quần xã nguồn bùn tự nhiên, quẫn xã anode của hệ SBES và quần xã hệ đối chứng.
Trong kết quả DGGE ở Hình 3.11, mỗi băng đại diện cho một loài có mặt trong quần xã, các băng đậm tương ứng với các chủng chiếm ưu thế trong quần xã, các băng mờ tương ứng là các chủng chiếm thiểu số. Số lượng băng của quần xã bùn tự nhiên ban đầu nhiều hơn hẳn hai quần xã còn lại, và số lượng băng của quần xã hệ đối chứng là ít nhất. Tuy nhiên, khó có thể kết luận quần xã nào có thành phần loài đa dạng hơn vì trong kết quả DGGE, không phải tất cả các loài có mặt trong mẫu phân tích đều được thể hiện trên bản gel, có thể những loài chiếm ưu thế đã “lấn át” sự biểu hiện của các loài chiếm số ít [62]. Dù vậy, có thể nhìn thấy sự tương đồng lớn giữa quần xã bùn tự nhiên với quần xã anode của hệ SBES vì
58
phần lớn các băng có mặt trên bản gel có vị trí trùng nhau. Có lẽ, nhiều vi khuẩn ưa mặn ưu thế trong quần xã nguồn cũng có hoạt tính điện hóa hoặc hoạt động tốt trong điều kiện điện hóa nên có thể thích nghi tốt khi hệ SBES có mặt.
Các băng đậm trong các điện di đồ DGGE của các đơn chủng không trùng với các băng đậm trong các điện di đồ DGGE của quần xã có nghĩa là những chủng ưu thế đã phân lập được bằng phương pháp truyền thống có thể không thực sự chiếm ưu thế trong quần xã. Điều này là có thể hiểu được, vì số lượng các vi sinh vật nuôi cấy được chưa tới 1% tổng số vi sinh vật [60].