Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định đa hình đơn

1.4. Kỹ thuật xác định đa hình đơn gen ALDH2

1.4.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định đa hình đơn

1.4.2.1. Kỹ thuật PCR

Nguyên tắc của phản ứng PCR dựa vào hoạt tính của các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch DNA khuôn, với nguyên liệu là bốn loại nucleotide tự do. Phản ứng này đòi hỏi sự có mặt của những mồi xuôi và mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự DNA khuôn.

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba bước như sau:

- Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation). Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử, thường là 94oC - 95oC trong vòng 30 giây - 1 phút.

- Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing). Nhiệt độ được hạ thấp cho phép các mồi bắt cặp với khuôn, dao động trong khoảng 40oC - 70oC, tuỳ thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây - 1 phút.

- Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension). Nhiệt độ được tăng lên 72oC để cho DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase, Tth polymerase, Pfu polymerase,…) hoạt động xúc tác quá trình tổng hợp tốt nhất.

Thời gian phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuyếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.

23

Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi DNA mới tạo thành sẽ tiếp tục được dùng để làm khuôn mẫu để tổng hợp các đoạn DNA mới trong chu kỳ tiếp theo. Sản phẩm cuối của phản ứng PCR là các đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài xác định là khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm được xác định bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi[8].

Hình 1.6. Nguyên lý kỹ thuật PCR Gen

cầnkhuếch đại

DNA

mẫu

Phản ứng khuếch đại

236 = 68 tỷ bản

4 bản sao 8 bản sao 16 bản sao 32 bản sao sao 1

chukỳ

2chu kỳ

3 chukỳ

35 chu kỳ Bước 1: biến tính

Bước 2: bắt cặp

Bước 3: tổng hợp

24 1.4.2.2. Kỹ thuật PCR-RFLP

- Nguyên lý: PCR-RFLP là kỹ thuật dựa trên cơ sở khuyếch đại có chọn lọc một đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR. Sau đó tiến hành phân cắt đoạn DNA này bằng một enzym cắt thích hợp. Các băng DNA sau khi chạy điện di và nhuộm ethidium bromide cho ta biết được tính đa hình thái của đoạn DNA cần phân tích [11].

- Enzym cắt giới hạn:

Enzym cắt giới hạn hay còn gọi enzym hạn chế, enzym cắt là enzym dưới nhóm quan trọng của các enzym endonuclease, enzym này cắt DNA ở các vị trí xác định dựa trên sự nhận biết đoạn trình tự đặc hiệu với từng enzym thành các đoạn DNA có kích thước khác nhau. Enzym cắt giới hạn được dùng để xác định alen liên quan đến các SNP do sự thay đổi 1 nucleotid trong mỗi SNP làm thay đổi đoạn trình tự đặc hiệu nhận biết bởi enzym cắt giới hạn trên đoạn DNA đó .

Bảng 1.2. Vị trí cắt của một số enzym giới hạn

Tên enzym Nguồn vi khuẩn Trình tự nhận biết EcoRI Eschericia coli RY13 5'-G↓AATTC-3' EcoRII Eschericia coli R245 5'-↓CCTGG-3' BamHI Bacillus amyloliquefaciens H 5'-G↓GATCC-3' SmaI Serratia marcesclens Sb 5'-CCC↓GGG-3' ApaI Acetobacter pasteurianus 5'-GGGCC↓C-3' SspI * Sphaerotilus natans 5'-AAT↓ATT-3'

Các enzym giới hạn có đặc điểm sau:

- Đều được chiết tách từ vi khuẩn, và tên của enzym giới hạn mang tên viết tắt của vi khuẩn

25

- Cắt phân tử DNA xoắn kép ở những trình tự base đặc hiệu (hay gọi vị trí giới hạn) cho từng loại enzym.

- Vị trí cắt thường có 4-8 Nu, đặc trưng quan trọng nhất của trình tự giới hạn là đoạn DNA gồm 4-8 cặp Nu có trình tự giống nhau khi đọc theo chiều 3-5 và 5-3.

Vì vậy, vị trí cắt của enzym giống nhau trên cả 2 mạch.

- Sau khi bị cắt, DNA có các đầu kết dính ở các sợi đơn. Cùng bị cắt với cùng loại enzym giới hạn, các phân tử DNA có các đầu kết dính với các Nu bổ sung cho nhau.

Ưu điểm kỹ thuật PCR-RFLP:rẻ tiền, không đòi hỏi máy móc hiện đại. Kỹ thuật đơn giản, dễ dàng áp dụng vào nhiều các nghiên cứu, phân tích chủ yếu đa hình đơn nucleotide.

Nhược điểm: Một vài enzym cắt giới hạn có giá đắt, khó khăn trong việc thiết kế mồi đặc hiệu, và enzym cắt thích hợp để thu được sản phẩm có kích thước khác nhau giúp cho việc nhận định và phân tích kết quả. Quy trình làm thủ công nên mất nhiều thời gian. Hạn chế thấy rõ nhất là khó có thể xác định kiểu gen nếu có nhiều SNPs khác nhau trên đoạn gen bởi nó đòi hỏi nhiều cặp mồi và enzym cắt khác nhau. Hơn nữa, kiểu gen và alen có thể bị nhận định sai nếu enzym cắt sản phẩm gen khuyếch đại không hoàn toàn [11].

1.4.2.3. Kỹ thuật giải trình tự gen

Hiện nay, người ta sử dụng máy giải trình tự gen tự động hoàn toàn được thiết kế trên nguyên tắc của Sanger. Với các máy thế hệ mới sau này, người ta dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP. Nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực hiện trong một ống nghiệm và chỉ cần điện di trên một hàng mà không phải trên 4 hàng khác nhau như trước đây, hệ thống điện di thường là điện di mao quản. Mỗi khi có một vạch điện di đi qua, phân tử ddNTP cuối cùng ở đầu 3’ của đoạn DNA sẽ phát ra một màu huỳnh quang tương ứng, máy sẽ ghi nhận màu sắc này và chuyển về máy tính phân tích. Dựa vào màu huỳnh quang mà máy nhận diện được là nucleotid nào, từ đó biết được trình tự của DNA đích.

26

Phương pháp giải trình tự gen cho phép phát hiện tất cả các đột biến, đặc biệt là các đột biến điểm, do đó kỹ thuật này được áp dụng cho việc phát hiện một số SNP không có vị trí cắt enzym giới hạn của gen, đồng thời cũng được sử dụng như một phương pháp đối chứng để kiểm tra độ chính xác, độ đặc hiệu của phương pháp PCR-RFLP [47], [31], [50].

27

CHƯƠNG 2.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu

Nhóm bệnh: 156 bệnh nhân được chẩn đoán xác định ung thư gan nguyên phát đang được theo dõi và điều trị tại Bệnh viện Bạch Mai và Bệnh viện K Trung ương từ tháng 1/2014-12/2015.

Bệnh nhân cả hai giới được chẩn đoán xác định UTGNP khi có một trong những tiêu chuẩn sau và đồng ý tham gia nghiên cứu [65]:

- Có bằng chứng về mô bệnh học hoặc tế bào học

- Có khối u gan + AFP > 400ng/ml và nhiễm HBV hoặc HCV.

- Kiểm tra trên siêu âm thấy có u

- Kích thước 1-2 cm, chẩn đoán xác định khi

 Hình ảnh điển hình với 2 phương pháp chẩn đoán hình ảnh động, hoặc

 Hình ảnh điển hình với 1 phương pháp chẩn đoán hình ảnh động + AFP

> 200ng/ml.

- Kích thước khối u > 2cm, chẩn đoán xác định khi

 Hình ảnh điển hình với 1 phương pháp chẩn đoán hình ảnh động, hoặc

 Hình ảnh không điển hình + AFP > 400 ng/ml Tiêu chuẩn loại trừ

- Ung thư di căn từ cơ quan khác tới.

- Bệnh nhân có ung thư cả những cơ quan khác ngoài gan.

- Bệnh nhân không đồng ý hợp tác nghiên cứu.

Nhóm chứng:159 người khỏe mạnh tình nguyện tham gia nghiên cứu.

Khai thác thông tin sử dụng rƣợu: Hỏi trực tiếp đối tượng cần nghiên cứu.

Phương pháp đo lượng rượu tiêu thụ: sử dụng bộ câu hỏi để thu thập các thông tin:

- Thời gian uống rượu: tính bằng số năm, từ khi bắt đầu uống rượu đến thời điểm nghiên cứu.

- Tần suất sử dụng rượu: mức độ thường xuyên uống rượu, số lượng cốc trong ngày, số ngày trong tuần/tháng, số tháng trong năm.

28 - Loại cốc thường sử dụng, thể tích cốc.

- Loại rượu sử dụng: quy ra hàm lượng rượu nguyên chất 20 g rượu (50 ml rượu Vodka), 15 g rượu (330 ml bia), 12,5 g rượu (100ml rượu vang).

Dựa vào số lần sử dụng rượu trong tháng, thể tích cốc sử dụng, số gram rượu quy đổi của từng loại rượu sẽ tính được lượng rượu tiêu thụ trong tháng và theo ngày (phụ lục 7).

Tiêu chuẩn xác định nhiễm virus viêm gan B: HbsAg dương tính 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian thực hiện nghiên cứu khóa luận từ 01/01/2014 đến 31/12/2015 - Địa điểm: Bộ môn Hóa sinh trường Đại học Y Hà Nội

Trung tâm Nghiên cứu Gen và Protein, trường Đại học Y Hà Nội 2.3. Phương pháp nghiên cứu:

2.3.1. Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả cắt ngang có nhóm chứng 2.3.2. Cỡ mẫu:

Chọn cỡ mẫu: Tính cỡ mẫu nghiêndựa theo công thức tính cỡ mẫu nghiên cứu bệnh chứngcủa Tổ chức Y tế thế giới:

n : cỡ mẫu, α=0,05 thì z2α=1,96, β=0.2 thì z2β=1,04.

p1 : tỷ lệ mang gen ALDH2*1/*1 nhóm chứng , q1=1- p1

p1= 0,68 được lấy từ nghiên cứu tham khảo trên cộng đồng người Trung Quốc [36].

p2 : tỷ lệ mang gen ALDH2*1/*1 nhóm bệnh , q2=1- p2

p=(p1+p2)/2, q=1-p

Ước lượng OR=2,5ta tính được p2=0,84 Thay vào công thức ta có : n= 127

29

Trong nghiên cứu này, cỡ mẫu lựa chọn là 156 bệnh nhân nhóm bệnh và 159 đối tượng trong nhóm chứng.

2.3.3. Cách thức tiến hành.

Tiến hành theo các bước sau:

- Xây dựng biểu mẫu thông tin bệnh nhân thống nhất đáp ứng với những tiêu chí đưa ra.

- Lựa chọn nhóm đối tượng nghiên cứu theo tiêu chuẩn đã nêu - Lấy mẫu nghiên cứu theo đúng tiêu chuẩn kỹ thuật

- Phân tích tỷ lệ kiểu gen và alen ALDH2 ở bệnh nhân UTGNP bằng kỹ thuật PCR-RFLP theo phương pháp được thực hiện bởi Yokoyama và cộng sự.

- Mối liên quan gen ALDH2 với một số yếu tố nguy cơ.

Bước 1: Lấy mẫu

- Thực hiện lấy mẫu ngoại vi của nhóm bệnh nhân UTGNP và nhóm người lành làm chứng. Mẫu máu lấy 3ml máu tĩnh mạch, có chống đông EDTA (1mg EDTA/1ml máu toàn phần).

Bước 2: Tách chiết DNA từ máu ngoại vi gồm 3 khâu - Tách chiết DNA

- Đo nồng độ và kiểm tra độ tinh sạch của DNA bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang (OD: Optical Density)bước sóng A260/A280 trên máy Nanodrop 1000.

Kết quả OD của mẫu DNA được coi là đạt khi nồng độ khoảng 50ng/àl trở lờn. Với những mẫu cú nồng độ quỏ cao >300 ng/àl sẽ được pha loóng để đưa nồng độ

<100ng/àl. Độ tinh sạch DNA được đo bằng tỷ số A260/A280, và mẫu DNA tinh sạch khi tỷ số này từ 1,8-2,0

- Điện di DNA trên gel Agarose để kiểm tra sự toàn vẹn của DNA.

Bước 3: Thực hiện khuyếch đại đoạn gen ALDH2 bằng phương pháp PCR:

- Khuyếch đại đoạn gen ALDH2 bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu.

Mồi xuôi: 5’ -CAA ATT ACA GGG TCA ACT GCT- 3’

Mồi ngƣợc: 5’ -CCA CAC TCA CAG TTT TCT CTT- 3’

30 Thành phần phản ứng PCR

STT Thành phần Thể tớch (àl)

1. Khuụn DNA (20 - 50ng/àl) 1

2. Taq buffer 10X 2

3 dNTP 2.5Mm 1

4 Taq polymerase 0,1

5 Mồi xuụi (10 pmol/àl) 0,2

6. Mồi ngược (10 pmol/ àl) 0,2

7. Nước tinh khiết 15,5

Tổng thể tích 20

Chu trình nhiệt:

94°C trong 5 phút 94°C trong 30 giây

55°C trong 30 giây 35 chu kỳ 72°C trong 30 giây

72°C trong 5 phút Bảo quản ở 15°C

Điện di 2 àl sản phẩm PCR trờn gel agarose 1,5%, ở điều kiện 90V trong 30 phút, kiểm tra kích thước sản phẩm sau PCR, nếu đúng kích thước 135bp và cho băng đặc hiệu duy nhất thì sản phẩm đó sẽ được sử dụng là khuôn cho phản ứng cắt enzyme giới hạn.

Bước 4: Xác định SNP của đoạn gen ALDH2 sử dụng enzym cắt giới hạn:

Để xác định vùng SNP codon 487 gen ALDH2 chúng ta đã sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuyếch đại đoạn gen có chiều dài 135 bp có chứa trình tự nhận biết ở codon 487: GAAGA(N8) của enzym cắt giới hạn MboII. Vị trí cắt của enzym sẽ sau trình tự nhận biết 8 nucleotid. Trong trường hợp bình thường ở codon 487 là GAA (Glutamat) thì enzym giới hạn sẽ nhận biết được và cắt đoạn gen này thành hai băng

31

có kích thước 126 bp và 9 bp khi điện di kiểm tra trên gel agasore 3% hoặc trên gel polyacrylamide 12%. Nhưng trong trường hợp biến đổi ở codon487 G>A sẽ chuyển GAA (glutamat) thành AAA (lysine) sẽ làm thay đổi trình tự nhận biết và enzym sẽ không nhận biết được nên sẽ không cắt đọan gen trên do vậy khi điện di kiểm tra chỉ có một băng duy nhất có kích thước 135bp. Trong trường hợp dị hợp tử, chỉ có một alen bị biến đổi chuyển G>A thì sau khi xử lý với enzym cắt giới hạn điện di kiểm tra cho ba băng với kích thước khác nhau là 135 bp, 126 bp và9 bp. Tuy nhiên, trong cả hai trường hợp, do băng có kích thước 9bp quá nhỏ nên không thể phát hiện được trong quá trình điện di và chỉ còn lại các băng có kích thước là 135 bp và/hoặc 129 bp mà thôi.

Phản ứng cắt enzym giới hạn xác định SNP vùng codon 487 gen ALDH2:

Thành phần Thể tớch (àl)

Sản phẩm PCR 8

Tango Buffer 10X 1,5

Enzyme MboII (10 U/àl) 1

Nước tinh khiết 4,5

Tổng thể tích 15

Hỗn hợp phản ứng cắt được ủ ở 37oC qua đêm

Điện di 15 àl sản phẩm PCR trờn gel agarose 3%, ở điều kiện 60V trong 90 phỳt sau đó tăng lên 90V trong 50 phút. Nhuộm băng DNA bằng ethidium bromide, soi và chụp ảnh băng DNA trên máy chụp ảnh gel EC3 Imaging system. Đọc kết quả các dạng allele của SNP .

Bước 5: Phân tích kết quả, so sánh giữa 2 nhóm bệnh và nhóm chứng.

2.3.4. Trang thiết bị và hóa chất

Trang thiết bị: dụng cụ phải được vô trùng tuyệt đối (hấp ướt 120oC trong 20 phút) - Máy hấp vô trùng dụng cụ

- Máy Gene Amp PCR System 9700 (USATủ lạnh sâu (-30oC, -80oC), tủ ấm.

32

- Máy đọc trình tự gen 3100-Avant Genetic Analyzer của hãng ABI-PRISM - Lò vi sóng (Samsung)

- Máy ly tâm để bàn Eppendorf (Đức), máy ly tâm lạnh Beckman (USA) - Hệ thống điện di ngang Mupid (Nhật Bản)

- Máy soi gel và chụp ảnh tự động: Chemidoc EQ-Bio-Rad (USA) - Máy đo nồng độ DNA Nano Drop 1000 (Mỹ).

- Bồn ủ nhiệt - Buồng hút

- Pipettor, pipette tip, polypropylene tube

- Ống PCR, ống effpendorf 1,5ml, ống Falcon, găng tay, giấy thấm đã được vô trùng tuyệt đối.

Hóa chất:

Tách chiết DNA từ máu toàn phần:phương pháp phenol/chloroform.

 Dung dịch Lysis buffer, Dung dịch K.

 Dung dịch SDS 10%, Proteinase K (10mg/ml).

 Dung dịch phenol : chloroform : isoamyl với tỷ lệ 25 : 24 : 1.

 Dung dịch chloroform : isoamyl với tỷ lệ 24 : 1.

 Ethanol 100% và ethanol 70%, Sodium acetate 3M, pH = 5,2

 Dung dịch hòa tan DNA (TE hoặc nước lọc 2 lần đã được khử trùng).

Kỹ thuật PCR: dung dịch đệm, cặp mồi đặc hiệu, dNTP, DNA polymerase, Mg2+, nước cất.

Điện di sản phẩm PCR: gel agarose, dung dịch TBE (boric acid EDTA), ethidium bromide, loading dye, thang DNA chuẩn.

Tinh sạch sản phẩm PCR: Theo phương pháp của Promega Wizard SV gel clean-up system (Promega Inc.) gồm dung dịch gắn kết màng, dung dịch rửa màng, nước cất không có nuclease.

Enzym cắt giới hạn: enzym cắt giới hạn đặc hiệu với mỗi dạng đa hình đơn của gen ALDH2: MboII.

33 Sơ đồ nghiên cứu:

Nhóm bệnh (156 bệnh nhân)

Nhóm chứng (159 người)

Mối liên quan giữa kiểu gen và yếu tố

nguy cơ

- Khám LS, khai thác tiền sử - Làm các XN CLS, chẩn đoán hình ảnh, GPB…

- Tách chiết DNA

- Khuếch đại gen ALDH2 bằng PCR - Điện di kiểm tra

- Tinh sạch sản phẩm PCR - Sử dụng enzym cắt giới hạn - Điện di xác định kiểu gen - Kiểm tra kết quả kiểu gen trên Genebank

KẾT QUẢ Thu thập mẫu

máu ngoại vi

Xác định kiểu gen, alen

KẾT LUẬN

34 2.4. Phương pháp xử lý số liệu

- Phương pháp thống kê và kiểm định Chi-Square (χ2) trên phần mếm SPSS 12.0.1được sử dụng để đánh giá tỷ lệ các alen, các kiểu gen và mối tương quan giữa chúng với ung thư gan. Sử dụng kiểm định trung vị (Median) để so sánh trung vị của tuổi phát hiện bệnh UTGNP.

- Tỷ suất chênh (Odds Ratio: OR) và 95% độ tin cậy (Confidence Interval:

CI) về tương quan giữa tính đa hình thái của đoạn gen ALDH2 và ung thư gan nguyên phát và một số các yếu tố nguy cơ được tính toán theo phương pháp hồi quy đa biến.

2.5. Đạo đức trong nghiên cứu của đề tài

 Các đối tượng tham gia nghiên cứu là hoàn toàn tự nguyện và có quyền rút lui khỏi nghiên cứu khi không muốn tham gia nghiên cứu.

 Các thông tin liên quan đến bệnh nhân được đảm bảo bí mật.

 Các kỹ thuật, thao tác liên quan đến bệnh nhân được bảo đảm đúng chuyên môn.

 Đề tài nghiên cứu này được thực hiện hoàn toàn vì mục đích khoa học chứ không vì mục đích nào khác.