3.2.1.1. Nhân bản đoạn gen từ 8155 - 8366 bằng PCR
Để xác định sự thay đổi nucleotide G thành tại vị trí 8344 trên mtDNA chúng tôi đ tiến hành nhân bản đoạn gen có kích thước 212 bp bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu được thiết kế bởi Trương Thị Huệ và tập thể [56], như bảng 3.1.
Bảng 3.1: Trình tự mồi nhân đoạn gen 8155 - 8366
Tên mồi Vị trí gắn Trình tự mồi Chu trình nhiệt
Sản phẩm
PCR
hững cải tiến
MRAGFw 8155 – 8175
5’GGT T CTA CGG TCA ATG
CTC 3’ 94ºC: 30 giây 58ºC: 30 giây 72ºC: 30 giây
212 bp
Mồi Rv chứa một nucleotide không ghép cặp (T đƣợc thay thế bằng G tại vị trí 8347) để
tạo điểm cắt cho BanII khi có
đột biến MRAGRv 8366 – 8345
5’ TTT C C TGT AAA GAG GTG TGG G 3’
44
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 2% (Hình 3.2) cho thấy sản phẩm DN khuếch đại của đoạn gen có kích thước như tính toán lý thuyết (212 bp), điều này chứng tỏ chúng tôi đ nhân bản thành công đoạn gen 8155 - 8366 từ mẫu DN tổng số của các bệnh nhân.
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm P R đoạn gen 8155 - 8366 M: Thang chuẩn DNA 100 bp
(-): Đối chứng âm (không chứa DNA khuôn)
(+): Sản phẩm PCR từ plasmid mang đột biến A8344G 1-7: Sản phẩm PCR từ mẫu DNA tổng số của bệnh nhân 3.2.1.2. Phân tích sự có mặt của đột biến A8344G bằng PCR-RFLP
Đoạn gen chứa đột biến sau khi đƣợc khuếch đại bằng PCR và kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 2% đƣợc cắt trực tiếp bằng enzyme giới hạn BanII.
Theo tính toán lý thuyết, đoạn gen 8155 - 8366 không chứa đột biến sẽ bị cắt thành ba đoạn có kích thước tương ứng là 99 bp, 72 bp và 41 bp; trong khi đó đoạn gen có đột biến sẽ cắt thành bốn băng với kích thước lần lượt là 99 bp, 50 bp, 41 bp và 22 bp, đột biến làm xuất hiện điểm cắt của enzyme BanII khiến băng 72 bp bị cắt thành hai băng 50 bp và 22 bp (Bảng 3.2).
45
Bảng 3.2: Trình tự và sản phẩm cắt của enzyme BanII Trình tự cắt Đệm dùng cho
enzyme
Sản phẩm cắt
đột biến không đột biến GGGCC/C
GAGCC/C GGGCC/C
R
99 bp, 41 bp, 50 bp và 22 bp
99, 41 bp và 72 bp
Sản phẩm cắt đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 12% và phát hiện đột biến dựa vào sự khác nhau về kích thước của phổ băng DN dưới ánh sáng t ngoại (Mục 2.2.6).
Hình 3.3. Điện di sản phẩm PCR-RF P đoạn gen 8155 - 8366 của bệnh nhân M: Thang chuẩn DNA
(-): Sản phẩm PCR-RFLP plasmid 8344A (+):Sản phẩm PCR-RFLP plasmid 8344G 1-7: Sản phẩm PCR-RFLP của bệnh nhân
Kết quả điện di sản phẩm PCR-RFLP (hình 3.3) cho thấy các mẫu DN nhân bản của bệnh nhân (đường chạy 4 - 10) đều xuất hiện 3 băng có kích thước tương ứng là 99 bp, 72 bp và 41 bp, giống với sản phẩm cắt của plasmid không mang đột biến, trong khi đó đối chứng dương là plasmid mang đột biến bị cắt thành 4 băng có kích thước tương ứng là 99 bp, 50 bp, 41 bp và 22 bp (đường chạy thứ 3). Chứng tỏ,
46
kết quả PCR-RFLP của chúng tôi là đáng tin cậy, các mẫu bệnh nhân (nêu ở đây là 7 bệnh nhân) đƣợc sàng lọc không mang đột biến 8344G. Thực tế, chúng tôi đ sàng lọc đột biến 8344G ở 312 bệnh nhân và không phát hiện thấy bệnh nhân nào mang đột biến 8344G.
3.2.2. Sàng lọc đột biến T8356
Tiếp tục sàng lọc các đột biến thuộc hội chứng MERRF, chúng tôi tiến hành điều tra đột biến T8356C trên 182 bệnh nhân nghi mắc bệnh cơ n o ty thể (Phụ lục 1) bằng phương pháp PCR-RFLP theo các bước tương tự như trên.
3.2.2.1. Nhân bản đoạn gen từ 8166 - 8358 bằng PCR
Đoạn gen chứa đột biến T8356C phải đƣợc khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi được thiết kế bởi Trương Thị Huệ và tập thể [56], như bảng 3.3, chúng tôi nhân bản được đoạn DN từ vị trí 8166 đến 8358, với kích thước 220 bp.
Bảng 3.3: Trình tự mồi cho phản ứng PCR đoạn gen 8166 - 8358
Tên mồi Vị trí gắn Trình tự mồi
Chu trình nhiệt
Sản phẩm
PCR
hững cải tiến
MRTCFw 8166 – 8189
5’GTC T GCTCTGA AATCTGT
GG G 3’ 94ºC: 30 giây 60ºC: 30 giây 72ºC: 30 giây
220 bp
Mồi Rv chứa một nucleotide không ghép cặp (G đƣợc thay thế
bằng T tại vị trí 8359) để tạo điểm cắt cho DraI khi không
đột biến MRTCRv 8385 – 8257
5’GT GT TTTAGTT GGGGCAT TTCACTT T 3’
47
Kiểm tra sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di trên gel agarose 2%
(Hình 3.4) cho thấy chỉ có một băng DN duy nhất, kích thước 220 bp được nhân lên. Ở thí nghiệm đối chứng âm không xuất hiện băng DN nào, chứng tỏ kết quả PCR là đúng so với những tính toán lý thuyết.
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm P R đoạn gen 8166 - 8385 M: Thang chuẩn DNA 100 bp
(-): Đối chứng âm
(+): Sản phẩm PCR plasmid mang đột biến T8356C 1-7: Sản phẩm PCR từ mẫu DNA tổng số của bệnh nhân 3.2.2.2. Phân tích sự có mặt của đột biến T8356C bằng PCR-RFLP
Sản phẩm PCR ở trên đƣợc cắt trực tiếp bằng enzyme giới hạn DraI. Enzyme này sẽ nhận điểm cắt có trình tự TTT/ trên đoạn gen 8166 - 8385 không chứa đột biến và cắt đoạn DN 220 bp thành hai đoạn có kích thước tương ứng là 192 bp và 28 bp, trong khi đó đoạn gen có đột biến không có trình tự này nên không bị cắt.
Kiểm tra sản phẩm cắt bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 12%
và phát hiện đột biến dựa vào sự khác nhau về kích thước của phổ băng DN dưới ánh sáng t ngoại.
48
Hình 3.5. Điện di sản phẩm PCR-RF P đoạn gen 8166 - 8385 của bệnh nhân M: Thang chuẩn DNA
(+): Sản phẩm PCR-RFLP của plasmid 8356C (-): Sản phẩm PCR-RFLP của plasmid 8356T 1-7: Sản phẩm PCR-RFLP của bệnh nhân
Phổ băng điện di cho thấy tất cả sản phẩm PCR của các mẫu bệnh nhân (đường chạy 2-8) đều bị cắt thành 2 đoạn DN có kích thước 192 bp và 28 bp (hình 3.5) giống nhƣ tính toán lý thuyết, chứng tỏ các mẫu bệnh nhân nghiên cứu không mang đột biến T8356C. Thực tế, chúng tôi đ điều tra 182 bệnh nhân và không phát hiện thấy trường hợp nào mang đột biến T8356C.