2.1. Phương tiện
2.1.1. Thời gian và ịa iể
Thí nghiệm đƣợc thực hiện từ tháng 8/2011 đến tháng 5/2012 tại phòng thí nghiệm Nedo và nhà lưới bộ môn Bảo vệ Thực vật, khoa Nông Nghiệp và SHƯD, trường Đại Học Cần Thơ.
2.1.2. Dụng cụ thí nghiệ
- Kính soi nổi, kính hiển vi, đĩa petri, chai thủy tinh, đèn cồn, đũa cấy, giấy thấm, nước cất, kim mũi giáo, lame, lamelle, máy chụp hình, giấy báo, băng keo trong, bọc nilon, dung dịch quan sát nấm (coton blue, nước cất, lactose phenol)…
- Tủ thanh trùng ƣớt, tủ thanh trùng khô, tủ cấy, tủ úm.
2.1.3. Vật iệu thí nghiệ
Mẫu a
Ba mươi mẫu lúa giám định được thu ở ba huyện: Trà Ôn, Tam Bình, Bình Minh của tỉnh Vĩnh Long trong vụ Hè Thu 2011.
Nguồn nấ
Nấm đƣợc phân lập trên các hạt lúa bị bệnh.
Môi trường sử dụng trong thí nghiệ (Potato Dextrose Agar - PDA) - Agar 20g
- Khoai tây 200g - Đường dextrose 20g - Nước cất 1000ml - pH 6,7
Giống a ể y bệnh nh n t o: IR50404, OM5451.
2.1.4. C ch thu ẫu
- Trên mỗi ruộng thu từ 20-30 bông lúa bệnh ở nhiều điểm khác nhau (5 điểm trên hai đường chéo góc).
- Lúa đƣợc thu ở ba huyện, mỗi huyện thu 10 mẫu, thu những bông lúa có hạt chắc và hạt lép trên cùng một bông. Thu những cây lúa đồng đều nhau về chiều cao và màu sắc trên cùng một mảnh ruộng, không thu những cây lúa cao hay lùn lọt sọt.
- Lúa đƣợc thu b vào tờ giấy báo (đã xếp sẵn) rồi để khô tự nhiên và quan sát.
2.2. Phương ph p
2.2.1. X c ịnh c c thành phần nấ g y h i tr n h t
X c ịnh t n nấ g y h i theo quy trình Koch - Bước 1: Mô tả triệu chứng và tìm mầm bệnh trong mô bệnh.
- Bước 2: Phân lập, tách ròng và định danh mầm bệnh.
- Bước 3: Tiêm, chủng mầm bệnh đã phân lập vào cây mạnh. Quan sát lại triệu chứng bệnh xuất hiện.
- Bước 4: Tái phân lập mầm bệnh từ vết bệnh được tiêm chủng và so sánh với mầm bệnh ban đầu.
C c bước tiến hành
Ủ hạt lúa trên đĩa petri theo phương pháp blotter (ISTA, 1985).
Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 30 nghiệm thức với bốn lần lặp lại, trong điều kiện ánh sáng đèn huỳnh quang. Đặt bốn lớp giấy thấm (đã thanh trùng) vào đĩa petri, sau đó dùng ống hút tưới nước cất (đã thanh trùng) cho đủ ẩm.
Ngâm hạt lúa trong cồn 700 từ 1-2 phút. Đặt 25 hạt/đĩa với khoảng cách đều nhau (xếp 25 hạt lúa thành 4 hàng, hàng thứ nhất 5 hạt, hàng thứ hai và thứ ba 7 hạt, hàng thứ tƣ 6 hạt, quan sát theo chiều từ phải sang trái, theo mặc định này thì đĩa petri đặt một cách ngẫu nhiên ta vẫn xác định đƣợc số thứ tự của bất kỳ hạt nào trong đĩa).
Đặt trong tủ úm 3 ngày ở nhiệt độ 300C, sau đó lấy ra để ở nhiệt độ phòng với chu kỳ 12h chiếu sáng và 12h tối xen kẽ, ủ đƣợc 5-7 ngày thì quan sát.
Hình 2.1: Cách ủ hạt lúa vào đĩa petri để cho nấm phát triển
Quan sát và mô tả đặc điểm nấm dưới kính soi nổi và kính hiển vi
- Hạt sau khi ủ 5-7 ngày, quan sát dưới kính soi nổi để nhận biết hình dạng bên ngoài cũng nhƣ cách mọc của từng loại nấm (mọc đứng, mọc lan, mọc lƣa thƣa hay thành từng chùm…) và chụp hình lại.
- Quan sát dưới kính hiển vi để nhận biết được hình dạng, màu sắc của sợi nấm và bào tử cũng nhƣ thấy đƣợc cách đính rõ hơn của từng loại nấm và chụp hình lại. Đo kích thước của 10 bào tử ở vật kính 40X rồi lấy trung bình.
Nuôi cấy và tách ròng nấm
Nuôi cấy nấm gây hại trên hạt lúa, phân lập, tách ròng và lưu trữ nguồn nấm trên môi trường PDA để thực hiện các thí nghiệm kế tiếp.
Xác định tên nấm gây bệnh
Xác định tên tác nhân gây bệnh căn cứ vào đặc điểm nấm trên ký chủ, sau đó so sánh hình dạng, kích thước, màu sắc của đính bào đài, đính bào tử và ổ nấm…
với khoá phân loại nấm của Barnett và Hunter (1998), cẩm nang nấm gây hại hạt lúa của Mew và Gonzales (2002) để kết luận tên tác nhân gây bệnh .
Lây bệnh nhân tạo trên bông lúa
- Phương pháp lây bệnh: Nguồn nấm lây bệnh nhân tạo đã được nuôi cấy thuần trong các đĩa petri trên môi trường PDA, dùng cây kim mũi giáo vạch theo hình chữ nhật với chiều rộng 3mm và chiều dài 5mm trên đĩa nấm đã thuần.
- Chuẩn bị những cây lúa kh e sạch bệnh, trồng cho đến khi gần trổ thì tiến hành lây bệnh ở giai đoạn cây lúa đang làm đòng, đem chậu lúa vào phòng chủng bệnh một ngày trước khi tiến hành lây bệnh nhân tạo, nhét những mảng nấm vừa vạch hình chữ nhật ở trên vào bông lúa, phun nước sương để giữ ẩm rồi trùm bông lúa lại
bằng bọc nilon và ghi ký hiệu trên bọc để dễ theo dõi. Tiếp theo, để chậu lúa đã lây bệnh nhân tạo trong phòng chủng bệnh một ngày, sau đó đem chậu lúa ra ngoài để ở chỗ mát và 3 ngày theo dõi 1 lần.
Chỉ ti u ghi nhận
- Ghi nhận thành phần nấm gây bệnh trên hạt qua sự quan sát hạt lúa ủ ở điều kiện ánh sáng đèn huỳnh quang.
- Xác định tần số xuất hiện (TSXH) của các loại nấm gây hại trên hạt trong điều kiện ánh sáng đèn huỳnh quang.
2.2.2. X c ịnh tần số xuất hiện của c c thành phần nấ g y bệnh tr n h t
Xác định TSXH của mỗi loại nấm trên tổng mẫu lúa quan sát A
TSXH (%) = x 100(%) Tổng số mẫu lúa
A: Số mẫu lúa xuất hiện loại nấm A
Xác định TSXH của một loại nấm trên tổng số hạt quan sát của một lần lặp lại B
TSXH 1 nghiệm thức = x 100(%)
Tổng số hạt lúa quan sát trong 1 lần lặp lại B: Số hạt lúa bị nhiễm 1 loại nấm của một lần lặp lại.
Xác định tần số xuất hiện của một loại nấm trên các giống lúa
Số hạt xuất hiện loại nấm D trên giống E/ Số mẫu lúa giống E
C(%) = x 100(%)
(Số hạt xuất hiện loại nấm D trên tất cả các giống lúa)
Xác định tần số xuất hiện của một loại nấm trên một giống lúa Số hạt xuất hiện loại nấm D trên giống E
F(%) = x 100(%)
Tổng số hạt lúa có xuất hiện nấm của giống E
CHƯƠNG 3