3.2. Trình t gen trnH-psbA c a loài Sao mặt quỷ
3.2.2. Kết quả nhân bản gen trnH-psbA bằng PCR
Mẫu ADN tổng số sau khi thu được được dùng làm khuôn để nhân bản đoạn gen trnH-psbA, sử dụng mồi xuôi - trnH ( 5’- CGC GCA TGG TGG ATT CAC AAT CC) và mồi ngược psbA (5’-GTT ATG CAT GAA CGT AAT GCT C). Phản ứng PCR được chạy trong tổng thể tớch 50àl, 30 chu kỳ.
Kết quả PCR sau đó đươc được di kiểm tra trên gel Agarose 1% (Hình 3.8).
Gen trnH-psbA là vùng gen lục lạp đã được chứng minh là marker phân tử phù hợp cho các nghiên cứu barcoding. Trong nghiên cứu này, với cặp mồi trnH (5’- CGC GCA TGG TGG ATT CAC AAT CC), psbA (5’-GTT ATG CAT GAA CGT AAT GCT C), 1 đoạn gen trnH-psbA dài 300bp sẽ được khuyếch đại. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% cho thấy đã xuất hiện 1 đoạn ADN có kích thước đúng như dự kiến, vạch rõ ràng, sắc nét, chứng tỏ sản phẩm PCR là đặc hiệu.
Hình 3.8. Kết quả thực hiện phản ứng PCR khuếch đại gen trnH-psbA (M: marker; giếng 1-2: Sao mặt quỷ thu tại khu bảo tồn thiên nhiên Khe Rỗ,
tỉnh Bắc Giang.) 3.2.3. Kết quả giải trình t gen trnH-psbA
Để kiểm tra sản phẩm PCR có khuếch đại đúng gen trnH-psbA hay không, sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng kít tinh sạch DNA extraction kit (QIAgen) và gửi đọc trình tự trên máy ABI 3100.
Kết quả giải trình tự gen trnH-psbA cho hình ảnh (các peaks) tương đối rõ ràng (hình 3.9), không bị nhiễu nền, chứng tỏ mẫu đã được tinh sạch tốt.
Hình 3.9. Sơ đồ các peaks của trình tự gen trnH-psbA của loài Sao mặt quỷ
So sánh trình tự gen trnH-psbA trên Blast-NCBI đã chứng tỏ đoạn gen thu được chính là gen trnH-psbA của loài Sao mặt quỷ.
3.2.4. So sánh trình t nucleotide mẫu nghiên cứu với một số loài khác thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae).
Hopea mollissima là loài có phân bố hẹp, hiện mới chỉ tìm thấy ở Việt Nam và tỉnh Hải Nam Trung Quốc. Những nghiên cứu ở cấp độ phân tử cho các loài họ Dầu ở Việt Nam gần như là chưa có, do vậy chúng tôi đã không tìm được trình tự gen trnH-psbA cho loài họ Dầu nào ở Việt Nam trên ngân hàng gen để so sánh.
Với mục tiêu bước đầu nghiên cứu và làm quen với phương pháp phân tích mối quan hệ di truyền của các loài gần g i trên cơ sở so sánh trình tự gen bằng phần mềm chuyên dụng ega 5.01, chúng tôi đã lựa chọn 3 loài họ Dầu có nguồn gốc từ Ấn Độ bao gồm (Hopea parviflora, Hopea racophloea, Shorea robusta và 1 loài ngoài nhóm là Pteleopsis anisoptera (thuộc họ Combretaceae)) (dữ liệu lấy từ ngân hàng gen) (bảng 2.1).
ết quả so sánh trình tự nucleotide gen trnH-psbA của 4 loài lấy từ ngân hàng gen và 1 loài Hopea mollissima của Việt Nam được trình bày ở hình 3.10.
Hình 3.10. So sánh trình tự vùng trnH-psbA của Sao mặt qủy với một số loài trong chi Sao và một số loài trong họ Dầu
3.2.5. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu nghiên cứu
Trong nghiên cứu này, khoảng cách di truyền giữa 5 mẫu so sánh đã được tính toán theo bộ dữ liệu tổng hợp của vùng nucleotide trnH-psbA dài 300 bp. Trình tự ADN đoạn gen trnH-psbA của 5 loài lựa chọn (bảng 2.1).
Sau khi được so sánh, cắt bỏ các phần không trùng khớp hai đầu thì còn lại 1 đoạn ADN dài 262 nucleotit, trong đó phần trăm các ba-zơ tương ứng được thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Thành phần các base (%) c a loài nghiên cứu
T C A G Total
H. racoploea 38.0 15.1 32.2 14.7 245
H. parviflora 38.4 14.3 33.1 14.3 245
H. mollissima pA ab1 33.7 14.2 33.2 19.9 246
Pteleopsis 40.2 12.1 32.4 15.3 281
Shorea robusta 32.4 14.2 39.3 14.1 262
Các tính toán về khoảng cách di truyền được thực hiện trên phần mềm MEGA 5.01 theo các thông số mặc định và mô hình hiệu chỉnh của Kimura, khoảng cách di truyền được tính theo cả đột biến hoán đổi (transition) nucleotide A - T hoặc G - C và hoán vị (tranversion) nucleotide A - C hoặc A - G hoặc T - C hoặc T - G. Dữ liệu ADN được coi là các trình tự tương đồng (homologous) có ngh a là các loài tiến hóa từ một tổ tiên.
Bản 3.3. Hệ số s á ữ ặ ỷ á l s sán .
1 2 3 4 5
1.H. racoploea
2.H. parviflora 0,013
3.H. mollissima pA ab1 0,074 0,079
4.Pteleopsis 0,273 0,261 0,369
5.Shorea robusta 0,670 0,653 0,749 0,718
ết quả phân tích về khoảng cách di truyền cho thấy đúng như dự đoán, 3 loài cùng chi Sao (Hopea) có khoảng cách di truyền thấp hơn hẳn cho với 2 loài còn lại (dao động từ 0,013 đến 0,079), đặc biệt 2 loài H. racoploea và H.
parviflora là 2 loài đặc hữu đều có nguồn gộc từ Ấn Độ nên khoảng cách di truyền của chúng là thấp hơn hẳn (0,013), so với loài Hopea mollissima của Việt Nam là 0,074 với H. racoploea và 0,079 với H. parviflora.
3.2.6. Xây d ng cây phát sinh ch ng loại
Từ kết quả về sự sai khác về trình tự nucleotide vùng trnH-psbA giữa Sao mặt quỷ với các loài được dùng so sánh, sơ đồ mối quan hệ di truyền giữa 5 loài này được thiết lập (hình 3.11). Sơ đồ đã thể hiện mối quan hệ giữa 3 loài cùng chi Hopea là gần g i hơn, thể hiện bằng nhóm chung trong cùng 1 nhóm. Hai loài còn lại là Pteleopsis anisoptera và Shorea robusta là 2 loài khác hẳn nhau về chi nên đã được thể hiện bằng 2 nhánh riêng biệt.
Hình 3.11. Mối quan hệ di truyền của Sao mặt quỷ với 1 số loài khác trên cơ sở phân tích trình tự vùng trnH - psbA bằng phương pháp
Maximum Parismony.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
Qua quá trình tiến hành nghiên cứu, chúng tôi đã thu được các kết quả chính như sau:
1.1. Đã xây dựng được bản mô tả loài Sao mặt quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu, 1957) ở Việt Nam, kèm theo một số thông tin về phân bố, sinh thái và giá trị tài nguyên, phân biệt với Sao hòn gai.
1.2. Nhân bản thành công vùng gen trnH – psbA của loài Sao mặt quỷ ở Việt Nam.
1.3. Đã giải mã và phân tích được trình tự gen trnH – psbA của loài Sao mặt quỷ ở Việt Nam.
1.4. Xây dựng được mối quan hệ di truyền của loài Sao mặt quỷ với một số loài khác thuộc chi Sao, họ Dầu.
2. K ến n ị
Hiện nay, các loài cây họ Dầu (Dipterocarpaceae) nói chung và Sao mặt quỷ nói riêng đang đứng trước nguy cơ bị đe dọa tuyệt chủng nghiêm trọng. Cho nên, cần có các nghiên cứu sâu hơn về các đặc tính sinh học c ng như những dẫn liệu di truyền ở cả cấp độ quần thể và loài, phục vụ công tác bảo tồn và phục hồi hiệu quả, góp phần bảo vệ đa dạng sinh học và phát triển kinh tế.