Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5 Phương pháp nghiên cứu
3.5.5 Phương pháp xét nghiệm
3.5.5.1 Phương pháp phát hiện kháng thể PCV2 trong mẫu huyết thanh: Bộ kít SERELISA® PCV2 Ab Mono Blocking (Synbiotics, Pháp)
23
Hình 3.1 Bộ kít ELISA dùng phát hiện kháng thể kháng PCV2 Nguyên lý
Bộ kít SERELISA ® PCV2 Ab Mono Blocking sử dụng kỹ thuật men miễn dịch phong bế (Blocking immuno-enzymatic technique) để phát hiện kháng thể chống PCV2 trong huyết thanh heo. Gồm 3 bước:
Bước 1: Đối chứng và mẫu được cho vào các giếng nhạy với kháng thể chống PCV2 (Ab1) liên kết đặc hiệu với kháng nguyên PCV2 tinh sạch. Kháng thể chống PCV2, nếu có trong mẫu huyết thanh thì sẽ liên kết với kháng nguyên.
Bước 2: Sau lần rửa sạch các thành phần không liên kết, tiếp hợp anti- PCV2/conjugate peroxidase được thêm vào. Nếu không có kháng thể chống PCV2 đặc hiệu trong mẫu, tiếp hợp anti-PCV2/conjugate peroxidase sẽ tự do kết hợp và tạo thành phức hợp sau:
(Ab1) – (Ag–PCV2) – (conj-HRP)
Bước 3: Sau lần rửa thứ 2, cặp đôi enzym được bộc lộ bởi cơ chất được thêm vào. Cơ chất này sẽ chuyển cặp đôi trên thành một sản phẩm phát màu. Mật độ quang được ghi nhận và dùng để xác định xem có hay không sự hiện diện kháng thể.
24
Sơ đồ 3.1 Qui trình phát hiện kháng thể kháng PCV2 bằng kỹ thuật ELISA Cho 100μl đối chứng âm vào các giếng A1, A2.
Cho 100 μl đối chứng dương vào các giếng B1, B2.
Cho 100μl mẫu huyết thanh đã pha loãng 1/100 vào các giếng còn lại Lắc nhẹ, ủ 1h ± 5 phút ở 370C ± 30C Rửa 4 lần với dung dịch rửa được pha loãng1/100 lần
Cho 100μl conjugate đã pha loãng 1/100 vào tất cả các giếng
Lắc nhẹ, ủ 1h ± 5 phút ở 370C ± 30C Rửa 4 lần với dung dịch rửa được pha loãng1/100 lần
Cho 100μl cơ chất vào mỗi giếng
Lắc nhẹ, ủ 30 phút ± 5 phút ở 200C ± 50C, tránh ánh sáng.
Cho 50μl dung dịch kết thúc vào tất cả các giếng.
Đo mật độ quang học (OD) ở bước sóng 450nm.
Tính toán kết quả
25 Đánh giá
Kết quả của mỗi thí nghiệm được công nhận nếu:
OD đối chứng âm > 0,800 và OD đối chứng dương < 0,500.
Phương pháp tính toán và giải thích như sau Phương pháp tính toán tỷ lệ:
Cho mỗi mẫu:
Tỷ lệ mẫu= OD mẫu / OD N
OD mẫu = trung bình mật độ quang học mẫu nếu phản ứng được tiến hành trên bản sao của các mẫu.
OD N = trung bình mật độ quang học của đối chứng âm.
Mẫu huyết thanh nào có tỷ lệ hiện diện ≤ 0,40 được xem là dương tính Mẫu huyết thanh nào có tỷ lệ hiện diện > 0,40 được xem là âm tính.
3.5.5.2 Phương pháp phát hiện kháng nguyên PCV2 trong mẫu phân: Bộ kít SERELISA® PCV2 Ag Capture (Synbiotics, Pháp)
Nguyên lý
Bộ kít SERELISA® PCV2 Ag Capture sử dụng kỹ thuật men miễn dịch sandwich (Sandwich immune – enzymatic technique) để phát hiện kháng nguyên PCV2. Phản ứng này được tiến hành trên phân và có 3 bước:
Bước 1: Đối chứng và mẫu được cho vào trong những giếng nhạy cảm với kháng kháng thể PCV2 (Ab). Nếu protein virus hiện diện trong mẫu thì nó sẽ kết hợp với kháng thể đặc hiệu.
Bước 2: Sau 1 lần rửa các phần không kết dính, một kháng kháng thể PCV2 hay peroxidase conjugate (conj-HRP) được thêm vào để bộc lộ kháng nguyên nhờ sự hình thành phức hợp sau:
(Ab) – (Ag-PCV2) – (conj-HRP)
Bước 3: Sau lần rửa thứ 2, enzym kết hợp với conjugate được thể hiện bởi sự thêm vào của 1 cơ chất và cơ chất này làm thay đổi phức hợp đó thành sản phẩm có màu sắc. Mật độ quang học được ghi nhận và được dùng để xác định sự hiện diện hay không hiện diện của kháng nguyên PCV2 dựa vào những giới hạn cụ thể.
26
Sơ đồ 3.2 Qui trình phát hiện kháng nguyên PCV2 bằng kỹ thuật ELISA Đối chứng: nhỏ 100 μl đối chứng dương; 100 μl đối chứng âm
Mẫu nhỏ 100 μl mẫu đã pha loãng
Ủ 50C ± 30 C qua đêm (14-18h)
Rửa 4 lần với dung dịch rửa đã pha loãng 1:100 Pha loãng conjugate (CJ) với dung dịch pha loãng conjugate (CD) theo
tỉ lệ 1:175; nhỏ 100 μl CJ đã pha loãng vào đĩa phản ứng Ủ 200C ± 50 C/60 ± 5 phút
Rửa 4 lần với dung dịch rửa đã pha loãng Nhỏ 100 μl cơ chất vào đĩa phản ứng
Ủ 200C ± 50 C/30 ± 5 phút Tráng ánh sáng và bọt khí Nhỏ 50 μl dung dịch stop vào đĩa phản ứng Đo OD ở bước sóng 450nm và đánh giá kết quả
Tính toán kết quả
27
Hình 3.2 Bộ kít ELISA dùng phát hiện kháng nguyên PCV2 Đánh giá:
Kết quả của mỗi thí nghiệm được công nhận nếu:
OD đối chứng âm < 0,300 và OD đối chứng dương > 0,500.
Kết quả:
Phương pháp tính toán và giải thích như sau:
Phương pháp tính toán tỷ lê:
Cho mỗi mẫu:
Tỷ lệ mẫu= OD mẫu / OD N
OD mẫu = trung bình mật độ quang học mẫu nếu phản ứng được tiến hành trên bản sao của các mẫu.
OD N = trung bình mật độ quang học của đối chứng âm.
Mẫu nào có tỷ lệ hiện diện ≥ 2,17 được ghi nhận là dương tính.
Mẫu nào có tỷ lệ hiện diện nằm trong khoảng 1,78 − 2,17 được xem là nghi ngờ.
Mẫu nào có tỷ lệ hiện diện ≤ 1,78 được xem là âm tính.